Utilisant le virus adéno-associé comme un outil pour étudier les obstacles dans la maladie de la rétine
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
Les cellules de Müller sont les principales cellules gliales de la rétine. Leurs pieds d'extrémité forment les limites de la rétine au niveau des membranes externe et interne (ILM) de limitation, et en liaison avec les astrocytes, des pericytes et des cellules endothéliales qu'ils établissent la barrière hémato-rétinienne (BRB). BRB limite transport de matière entre dans la circulation sanguine et la rétine tandis que le MFI agit comme une membrane de sous-sol qui définit histologiquement la frontière entre la rétine et la cavité vitréenne. Étiquetage cellules de Müller est particulièrement pertinent pour étudier l'état physique des barrières de la rétine, car ces cellules sont une partie intégrante de la BRB et ILM. Les deux BRB et ILM sont fréquemment modifiées dans les maladies de la rétine et sont responsables de symptômes de la maladie.
Il existe plusieurs méthodes bien établies pour étudier l'intégrité de la BRB, tels que le test bleu Evans ou angiographie à la fluorescéine. Cependant, ces méthodes ne fournissent pas d'informations sur l'ampleur de la perméabilité BRB to molécules plus grandes, dans la fourchette de nanomètre. En outre, ils ne fournissent pas d'informations sur l'état d'autres obstacles de la rétine comme l'ILM. Pour étudier BRB perméabilité aux côtés de la rétine ILM, nous avons utilisé une méthode basée AAV qui fournit des informations sur la perméabilité de la BRB à des molécules plus grandes tout en indiquant l'état des ILM et de matrice extracellulaire de protéines dans les états pathologiques. Deux variantes de l'AAV sont utiles pour cette étude: AAV5 et ShH10. AAV5 a un tropisme naturel pour photorécepteurs mais il ne peut pas obtenir à travers la rétine externe lorsqu'il est administré dans le corps vitré lorsque l'ILM est intacte (c. dans les rétines de type sauvage). ShH10 a un fort tropisme envers les cellules gliales et étiqueter sélectivement les cellules gliales Müller dans les deux rétines sains et malades. ShH10 fournit la livraison de gènes plus efficace dans les rétines où ILM est compromise. Ces outils viraux couplés par immunohistochimie et le sang-analyse de l'ADN éclairent sur l'état des barrières de la rétine dans la maladie.
Introduction
Les cellules de Müller sont le principal composant des cellules gliales de la rétine. Morphologiquement, ils se étendent radialement à la rétine et leur endfeet, en contact avec le corps vitré, et font face à la MLI secrètes composants de ce dernier. Le MFI est une membrane de sous-sol composée d'une dizaine de différentes protéines de la matrice extracellulaire (laminine, l'agrine, le perlecan, nidogène, le collagène et les protéoglycanes de sulfate plusieurs héparine). Au cours du développement, sa présence est indispensable pour histogénèse rétinienne, la navigation des axones optiques, et la survie des cellules ganglionnaires de 1-3. Cependant, ILM est inessentiel dans la rétine adulte et peut être enlevée chirurgicalement dans certaines pathologies sans causer de dommages à la rétine 4. Dans la thérapie génique, cette membrane est une barrière physique pour la transduction efficace de la rétine en utilisant AAV 5 par injection intravitréenne.
Grâce à l'arborisation étendue de leurs processus, les cellules de Müller fournissent suppo nutritionnel et réglementairert à la fois les neurones rétiniens et les cellules vasculaires. Les cellules de Müller sont également impliqués dans la régulation de l'homéostasie de la rétine, dans la formation et le maintien de la BRB 6. Jonctions serrées entre les cellules endothéliales des capillaires rétiniens, Müller cellules, les astrocytes et les péricytes forment la BRB. BRB empêche certaines substances de pénétrer dans les nombreuses maladies retina.In comme la rétinopathie diabétique, l'occlusion veineuse rétinienne et les maladies respiratoires, l'hypoxie de la rétine provoque une fuite à travers la BRB 7-9. Cette rupture est associée à une augmentation de la perméabilité vasculaire conduisant à l'oedème vasogénique, décollement de la rétine et des dommages de la rétine.
Les cellules de Müller sont étroitement associés avec les vaisseaux sanguins et la membrane basale, jouant un rôle important à la fois l'intégrité BRB et ILM. Par conséquent, l'étiquetage des cellules gliales Müller est particulièrement pertinent pour l'étude de l'état physique de ces obstacles rétiniennes.
Classiqueallié, BRB perméabilité est mesurée en utilisant le test bleu Evans consistant en l'injection systémique de colorant bleu Evans, qui se lie de façon non covalente à l'albumine plasmatique. Ce test mesure la fuite d'albumine (protéine de taille moyenne, ~ 66 kDa) des vaisseaux sanguins dans la rétine (voir Protocoles Section 5) 10. Alternativement, la fuite vasculaire peut être visualisé par angiographie rétinienne fluorescence attestant de fuite de la fluorescéine (petite molécule, ~ 359 Da, voir Protocoles Section 6) 11. Néanmoins, les deux méthodes permettent d'évaluer la perméabilité BRB à de petites molécules et des protéines, mais ils ne fournissent pas d'informations sur l'intégrité de ILM.
Par conséquent, pour étudier la perméabilité BRB, nous avons utilisé une méthode basée AAV qui donne des informations sur la perméabilité BRB à des molécules plus grandes (par exemple, les particules AAV, diamètre de 25 nm). En effet, notre méthode peut détecter la présence de l'AAV transgène dans le sang, ce qui suggère que les particules ~ 25 nm de diamètre feriezêtre capable de se infiltrer dans la circulation sanguine. Cette méthode fournit également des informations sur la structure du GIP et des protéines de la matrice extracellulaire dans des conditions pathologiques. Deux variantes de l'AAV sont utiles pour cette étude: AAV5 et ShH10. Sous-rétinienne injecté, AAV5 a un tropisme naturel pour les photorécepteurs et épithélium pigmentaire de la rétine 12, mais il ne peut pas obtenir à travers la rétine externe lorsqu'il est administré dans le corps vitré dans les rétines de type sauvage avec ILM intacte 5,13. ShH10 est une variante de l'AAV qui a été conçu pour cibler spécifiquement les cellules gliales plus de neurones 14,15. ShH10 étiquettes sélectivement les cellules de Müller dans les deux rétines sains et malades avec une efficacité accrue dans les rétines avec des barrières compromis 16. Ces outils viraux couplés avec immuhistochemistry et l'analyse de sang-ADN fournissent des informations sur l'état des barrières de la rétine et leur implication dans la maladie (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La BRB règle l'échange de molécules entre le sang et la rétine. Sa ventilation est associée à diverses maladies telles que la rétinopathie diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). Nous avons récemment montré que, dans une souris de la dystrophine knock-out, qui affiche perméable BRB, la rétine devient plus permissive à la livraison de gènes médié par des vecteurs viraux adéno-associés (AAV). Cependant, malgré la perméabilité BRB particules d'AAV injectée par …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
