एक उपकरण के रूप में एडिनो-एसोसिएटेड वायरस का प्रयोग रोग में रेटिना बाधाओं का अध्ययन करने के लिए
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
मुलर कोशिकाओं रेटिना के प्रिंसिपल glial कोशिकाओं रहे हैं। उनके अंत-पैर बाहर और भीतर सीमित झिल्ली (इल्म) में रेटिना की सीमा के फार्म, और astrocytes, pericytes और endothelial कोशिकाओं के साथ संयोजन के रूप में वे खून-रेटिना बाधा (BRB) की स्थापना। इल्म रेटिना और शीशे गुहा के बीच histologically सीमा को परिभाषित करता है कि एक तहखाने झिल्ली के रूप में कार्य करता है, जबकि BRB खून और रेटिना के बीच सामग्री परिवहन की सीमा। मुलर कोशिकाओं लेबल इन कोशिकाओं BRB और इल्म का एक अभिन्न हिस्सा हैं, के रूप में रेटिना बाधाओं की शारीरिक स्थिति का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। BRB और ILM दोनों अक्सर रेटिना रोग में बदल दिया और रोग के लक्षणों के लिए जिम्मेदार होते हैं।
ऐसे इवांस नीले परख या fluorescein एंजियोग्राफी के रूप में BRB की अखंडता का अध्ययन करने के लिए कई अच्छी तरह से स्थापित तरीके हैं। हालांकि इन तरीकों BRB पारगम्यता टी की सीमा पर जानकारी प्रदान नहीं करतेनैनोमीटर रेंज में बड़े अणुओं, ओ। इसके अलावा, वे इस तरह के इल्म के रूप में अन्य रेटिना बाधाओं के राज्य के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। रेटिना इल्म के साथ BRB पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए, हम रोग राज्यों में इल्म और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के राज्य का संकेत है, जबकि बड़े अणुओं को BRB की पारगम्यता के बारे में जानकारी प्रदान करता है कि एक एएवी आधारित पद्धति का इस्तेमाल किया। दो एएवी वेरिएंट इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं: AAV5 और ShH10। AAV5 फोटोरिसेप्टरों के लिए एक प्राकृतिक tropism है लेकिन इल्म बरकरार है जब (जंगली प्रकार retinas में यानी,) शीशे में दिलाई जब यह बाहरी रेटिना को भर में नहीं मिल सकता। ShH10 glial कोशिकाओं की दिशा में एक मजबूत tropism है और चुनिंदा स्वस्थ और रोगग्रस्त retinas के दोनों में मुलर glia लेबल होगा। ShH10 इल्म समझौता किया है जहां retinas में अधिक कुशल जीन डिलीवरी प्रदान करता है। Immunohistochemistry और खून-डीएनए विश्लेषण के साथ युग्मित ये वायरल उपकरण बीमारी में रेटिना बाधाओं के राज्य पर प्रकाश डाला।
Introduction
मुलर कोशिकाओं रेटिना के प्रमुख glial घटक हैं। आकृति विज्ञान, वे कांच के साथ संपर्क में त्रिज्यात रेटिना और उनके endfeet स्पैन इल्म और बाद के गुप्त घटकों का सामना। इल्म के बारे में दस अलग बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन (laminin, agrin, perlecan, nidogen, मज्जा और कई हेपरिन सल्फेट proteoglycans) से बना एक तहखाने झिल्ली है। विकास के दौरान, अपनी उपस्थिति नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं 1-3 की रेटिना ऊतकजनन, ऑप्टिक axons की नेविगेशन, और अस्तित्व के लिए अपरिहार्य है। हालांकि, इल्म वयस्क रेटिना में नगण्य है और शल्य चिकित्सा रेटिना क्षति 4 कारण के बिना कुछ विकृतियों में हटाया जा सकता है। जीन थेरेपी में, इस झिल्ली intravitreal इंजेक्शन 5 से AAVs का उपयोग कर रेटिना के कुशल पारगमन के लिए एक शारीरिक बाधा बन जाता है।
उनकी प्रक्रियाओं के व्यापक द्रुमायण के माध्यम से, मुलर कोशिकाओं पोषण और नियामक suppo प्रदान करते हैंRT रेटिना न्यूरॉन्स और नाड़ी कोशिकाओं दोनों के लिए। मुलर कोशिकाओं को भी BRB 6 के गठन और रखरखाव में, रेटिना homeostasis के नियमन में शामिल कर रहे हैं। तंग जंक्शनों रेटिना केशिका endothelial कोशिकाओं के बीच, मुलर सेल, astrocytes और pericytes BRB के रूप में। BRB मधुमेह रेटिनोपैथी, रेटिना नस रोड़ा और सांस की बीमारियों की तरह retina.In कई बीमारियों में प्रवेश करने से कुछ पदार्थों को रोकता है, रेटिना के हाइपोक्सिया BRB 7-9 के माध्यम से रिसाव का कारण बनता है। इस संबंध विच्छेद vasogenic शोफ, रेटिना टुकड़ी और रेटिना को नुकसान के लिए अग्रणी संवहनी पारगम्यता में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है।
मुलर कोशिकाओं कसकर दोनों BRB और ILM अखंडता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, रक्त वाहिकाओं और तहखाने झिल्ली के साथ जुड़े रहे हैं। नतीजतन, मुलर glial कोशिकाओं लेबलिंग इन रेटिना बाधाओं की शारीरिक स्थिति का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है।
क्लासिकसहयोगी, BRB पारगम्यता प्लाज्मा एल्बुमिन को गैर covalently बांधता है जो इवांस नीले डाई, के प्रणालीगत इंजेक्शन से मिलकर इवांस नीले परख का उपयोग मापा जाता है। यह परख रेटिना में रक्त वाहिकाओं 10 (प्रोटोकॉल धारा 5 देखें) से एल्बुमिन रिसाव (मध्यवर्ती आकार के प्रोटीन, ~ 66 केडीए) के उपाय। वैकल्पिक रूप से, संवहनी रिसाव fluorescein के रिसाव के लिए attesting प्रतिदीप्ति रेटिना एंजियोग्राफी द्वारा देखे जा सकते हैं (छोटे अणु, ~ 359 दा; प्रोटोकॉल धारा 6 देखें) 11। फिर भी, दोनों तरीकों छोटे अणुओं और प्रोटीन के लिए BRB पारगम्यता के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं, लेकिन वे इल्म अखंडता के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं।
इसलिए, BRB पारगम्यता अध्ययन करने के लिए, हम बड़े अणुओं (जैसे, एएवी कणों, 25 एनएम व्यास) को BRB पारगम्यता के बारे में जानकारी देता है कि एक एएवी आधारित पद्धति का इस्तेमाल किया। दरअसल, हमारे विधि सुझाव है कि, जो रक्त में एएवी transgene की उपस्थिति का पता लगाने कर सकते हैं ~ 25 एनएम व्यास कणों होगाखून में घुसपैठ करने में सक्षम हो। इस विधि को भी रोग की स्थिति में इल्म और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करता है। दो एएवी वेरिएंट इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं: AAV5 और ShH10। Subretinally इंजेक्ट, AAV5 फोटोरिसेप्टरों और रेटिना वर्णक उपकला 12 के लिए एक प्राकृतिक tropism है, लेकिन बरकरार इल्म 5,13 के साथ जंगली प्रकार retinas में शीशे में दिलाई जब यह बाहरी रेटिना को भर में नहीं मिल सकता। ShH10 विशेष रूप से न्यूरॉन्स 14,15 से अधिक glial कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए इंजीनियर किया गया है कि एक एएवी संस्करण है। ShH10 चुनिंदा समझौता बाधाओं 16 के साथ retinas में वृद्धि की दक्षता के साथ स्वस्थ और रोगग्रस्त retinas के दोनों में मुलर कोशिकाओं लेबल। Immuhistochemistry और खून-डीएनए विश्लेषण के साथ युग्मित ये वायरल उपकरण रेटिना बाधाओं के राज्य और बीमारी में उनकी भागीदारी (चित्रा 1) के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
BRB खून और रेटिना के बीच अणुओं के आदान-प्रदान को नियंत्रित करता है। इसके टूटने ऐसे मधुमेह रेटिनोपैथी या उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) के रूप में विभिन्न रोगों के साथ जुड़ा हुआ है। हमने हाल ही मे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
