나의 기능적 특성<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
엔도 솜 산성화는 시냅스 소포의 단백질 분해 및 재활용, 둔감 수용체 및 신경 전달 물질의 로딩 등의 처리, 다양한 중요하다. 이 산성화는 CLC 염화 컨베이어에 결합 된 양성자 -ATPase를,에 의해 매개되는 기술되어있다. electroneutral 양성자 수송을 고도로 보존, 나 + / H + 교환기 (NHE) 6, 7, 9는 이러한 구획에서 표현된다. 유전자의 돌연변이는 인간의인지 적, 신경 퇴행성 질환과 연결되어있다. 자신의 세포 내 현지화 상세한 기능 특성을 방지 것처럼 역설적으로 자신의 역할은 애매 남아있다. 이 논문은이 문제를 해결하는 방법을 나타내고있다. 이것은 세포막에서 세포를 유지하여 NHEs 급성 세포질 산성화 생존 가능한 돌연변이 세포주의 선택으로 구성. 그러므로 이온 선택성 및 활성을 측정하기 위해 두 개의 상보적인 프로토콜을 도시(ⅰ) 하나의 비디오 형광 현미경을 사용하여 세포 내 pH 측정에 기초하고, (ⅱ) 하나의 리튬의 빠른 흡수 동력학에 기초한 이러한 교환기. 이러한 프로토콜은 다른 비 electrogenic 수송차를 측정하도록 외삽 될 수있다. 또한, 여기에 제시된 선택 절차는 세포 표현형으로 고정 불량 셀을 생성한다. 따라서, 이러한 세포는 세포막에서 다른 소포 막 단백질을 발현한다. 여기에 묘사 된 실험 전략은 따라서 다음 소낭 + / H + 선택에 사용 교환기 나트륨과 함께 세포막에서 발현된다 다른 세포 내 단백질을 연구하기 위해 잠재적으로 강력한 도구를 구성 할 수있다.
Introduction
대부분의 세포 내 구획 성숙, 인신 매매, 단백질이나 호르몬과로드 신경 전달 물질의 재활용을위한 핵심 매개 변수입니다 산성 내강의 pH를 표시합니다. 그것은 세포질 포성 내용 사이의 pH 구배 소포 CLC 클로라이드 컨베이어 (2)에 결합 된 액포 H + -ATPase를 (1)에 의해 생성되는 것으로 밝혀졌다. 두 녹아웃 (KO) 마우스 및 인간 환자에서, 이들 컨베이어의 중요성 3-6 유전자 돌연변이로 인한 무거운 표현형에 의해 강조되었다.
나트륨 수소 교환기 SLC9A 가족의 구성원, 또한 나트륨 + / H + 교환기 NHEs 불리는 세포 내 pH 및 세포 볼륨 조절 키 이펙터에서뿐만 아니라 상피 걸쳐 산 – 염기 당량의 vectorial 수송 것으로 나타났다 . 세포막 NHEs 외에도 세 고도로 + / H + 기, NHE 6, 7은 Na 보존9는 트랜스 – 골지 네트워크에서 초기 엔도 좀 (7)로 표현된다. 유전자의 돌연변이는 엔젤 형 또는 크리스찬 증후군 8-9, 가족 기반의 자폐증 (10)와 주의력 결핍 과잉 행동 장애 11-12로 연결되어있다. 이 교환기는 또한 알츠하이머 병의 감수성 (13)과 X-링크 된 정신 지체 연속 유전자와 같은 신경 퇴행성 문제 (14) 증후군에 참여했습니다. 함께 찍은, 이러한 연구는 두뇌 발달 및 / 또는 기능에서 이러한 세포 내 NHEs의 중요성을 강조 표시합니다.
이러한 기의 세포 내 현지화 정확한 자신의 이온 선택성 측정, 전송 방향, 운동 매개 변수 및 규제를 방지 할 수 있습니다. 세포 내 구획에서 발현 모든 컨베이어의 경우와 같이, 자신의 생화학 활동을 평가하기 때문에 완전히 생리적 역할과 mechan을 이해하는 것은 매우 어렵다ISMS는 병적 인 의미를 기본. 높은 세포질 K + 농도에 따라, 가장 일반적으로 받아 들여지는 가설은 K + 결합 된 양성자 유출 컨베이어로 작업하는 것이 었습니다. 이 정상 상태 포성 산도를 유지하기 위해 V–ATPase를 펌핑하여 양성자를 상쇄 할 수있다 등의 양자 누출의 존재가 가정되었다. 이 시각 문서의 목적은 세포막에서 이러한 소포 수송차를 표현하고, (ⅱ) 이러한 수송의 기능을 측정하는 두 개의 독립적 인 방법을 보여 세포주의 유전을 선택할 수 있도록하는 방법을 설명하기 (I)이다.
세 년 전, Pouysségur과 프란은 NHE 가족 (15)의 구성원의 분자 클로닝 및 특성을 활성화 유전 적 접근 방식을 개척했다. 이 스크리닝 방법으로 세포 독성 양성자에 기초 하였다. 첫 번째 단계는 결핍 세포주를 수득 하였다어떤 나 + / H +의 교환이 전달체 가역성을 이용 세포막에서 발현. 섬유 아세포 (CCL39 세포주) 또는 리튬 나트륨 + + 미리로드 한 후 2 시간 동안 세포 외 산성 매질 (PH 6.5)에 넣었다. 이것은 기능적 나 + / H + 교환을 발현하는 세포의 죽음과 antiporter 결핍 세포 (PS120 세포주) (16)의 선택되었다. 중탄산없는 배지에서 배양하면, 이들 세포는 급성 세포 내 산성화에 매우 민감하다. 이러한 세포는 세포 급성 acidifications에 제출하는 경우 결과적으로, 세포막에서 기능적 양성자 유출기구의 발현 양 (도 17 참조)를 선택한다. 이러한 기술은 산성화 세포막에서 WT 세포 NHEs의 강제 발현을 활성화 결함 트래 피킹 세포주를 분리 할 수있다.
진핵 세포 나 + / H로교환기 electroneutral 있습니다 +, 그들은 채널을 측정하기 위해 큰 성공과 함께 사용 된 전기 생리 학적 방법에 의해 측정 할 수 없습니다. 이 원고 따라서 세포 내 pH 측정과 리튬의 빠른 흡수 동력학하여 교환기의 활성을 측정하는 방법을 설명한다. 기본 개념은 동일한하는, 그 선택 부 위해 개발 된 많은 프로세스는 또한 작용 성 측정에 사용되는 직접 통지 흥미 롭다.
흥미롭게도,이 논문에 설명 된 접근법을 사용하여 선택된 세포주에 존재 매매 결함은 소낭 칼륨 채널 TWIK1 18과 같이 세포막에 다른 소포의 단백질보다 발현에 이르게 것을 관찰했다. 이것은 소포 막 관통 단백질 일반적인 고정 결함기구의 선택을 향해 지적한다. 그러므로 이러한 선택 절차 및 5 월의 생성 세포세포 내 구획의 막 단백질에 근무하는 과학적인 지역 사회를위한 유망한 도구를 구성한다. 뿐만 아니라 여기에 제시된 측정 기술은 다른 비 electrogenic 운송을 연구 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 부위 특이 적 변이에 의해 자신의 기본 순서를 변경하지 않고 세포막에서 세포 나 + / H + 교환기를 발현하는 세포를 선택하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 교환기 이제 특성화 될 수있다.
이 방법은 세포막에 소포 나 + / H + 교환기를 표현한다 세포주를 선택하는 양성자 세포의 세포 독성에 기초한다. 여기에는 리튬 +,</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
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