Funktionelle Charakterisierung von Na<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
Endosomalen Ansäuerung ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von Prozessen, wie zB Protein-Recycling und Abbau, Rezeptordesensibilisierung und Neurotransmitter Belastung in synaptischen Vesikeln. Diese Ansäuerung wird beschrieben, dass durch Protonen-ATPasen, um ClC Chloridtransporter gekoppelt vermittelt werden. Hochkonservierten elektro Protonen Transporter sind die Na + / H + Austauscher (NHE) 6, 7 und 9 auch in diesen Kammern ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit der menschlichen kognitiven und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Paradoxerweise bleibt ihre Rolle schwer fassbar, da ihre intrazelluläre Lokalisation hat detaillierte funktionelle Charakterisierung verhindert. Diese Handschrift zeigt ein Verfahren, um dieses Problem zu lösen. Diese besteht aus der Auswahl der mutierten Zelllinien, fähig zu überleben akuten cytosolische Ansäuerung durch Halte intrazellulärem NHEs an der Plasmamembran. Es zeigt dann zwei sich ergänzenden Protokolle, um die Ionenselektivität und Aktivität zu messendieser Austauscher: (i) eine auf die intrazelluläre pH-Messungen unter Verwendung von Fluoreszenzvideomikroskopie, und (ii) eine auf der Basis der schnellen Kinetik der Lithiumaufnahme. Solche Protokolle können extrapoliert werden, um andere nicht-elektro Transporter zu messen. Darüber hinaus ist die hier vorgestellte Auswahlverfahren erzeugt Zellen mit einem intrazellulären Retention defekt Phänotyp. Daher werden diese Zellen exprimieren auch andere Vesikelmembran Proteine an der Plasmamembran. Die hier dargestellte experimentelle Strategie kann daher eine potentiell leistungsfähiges Werkzeug, um andere intrazelluläre Proteine, die dann an der Plasmamembran zusammen mit der vesikulären Na + / H + Austauscher für die Auswahl verwendet ausdrücken zu studieren.
Introduction
Die meisten intrazellulären Kompartimenten Anzeige eine saure luminalen pH-Wert, der einer der wichtigsten Parameter für die Reifung, Menschenhandel, Recycling von Proteinen oder Hormonen und Neurotransmittern Laden ist. Es wurde gezeigt, dass der pH-Gradient zwischen Cytosol und vesikulärer Gehalt durch vakuoläre H + ATPasen 1 erzeugt, um vesikuläre ClC Chloridtransporter 2 gekoppelt. Sowohl in Knock-out (KO) Mäusen und menschlichen Patienten ist die Bedeutung dieser Transporter durch die schweren Phänotypen, die durch Mutationen in ihren Genen 3-6 verursacht hervorgehoben.
Die Mitglieder des Sodium-Hydrogen Tauscher SLC9A Familie, genannt auch NHEs für Na + / H + Austauscher haben, dass sie Schlüssel Effektoren der intrazellulären pH-Wert und Zellvolumenregulation sowie in vektorieller Transport von Säure-Basenäquivalente durch das Zellgewebe sein . Neben der Plasmamembran NHEs drei hochkonservierten Na + / H + Austauscher NHE 6, 7und 9 sind in trans-Golgi Netzwerk und Anfang Endosomen 7 ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit Angelman-like oder Christi Syndrome 8-9, familienbasierten Autismus 10 und Aufmerksamkeits-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung 11-12 verbunden. Diese Tauscher auch bei neurodegenerativen Probleme wie Alzheimer Krankheitsanfälligkeit 13 und X-chromosomale geistige Retardierung zusammenhängenden Gene Syndrome 14 beteiligt. Zusammen genommen verdeutlichen auch diese Studien die Bedeutung dieser intrazellulären NHEs der Gehirnentwicklung und / oder Funktion.
Die intrazelluläre Lokalisation dieser Tauscher verhindert genaue Messungen der Ionenselektivität, Transportrichtung, kinetische Parameter und Regulierung. Wie ist der Fall für alle Transporter in intrazellulären Kompartimenten ausgedrückt, äußerst schwierig, ihre biochemischen Aktivitäten zu bewerten und damit zu ihrer physiologischen Funktionen und die mechan vollständig zu verstehen istIsmen zugrunde liegenden pathologischen ihre Auswirkungen. Aufgrund der hohen cytosolische K + -Konzentration, war die allgemein akzeptierte Hypothese, dass sie als K + gekoppelten Protonen Efflux-Transporter arbeiten. Die Existenz einer solchen Protonenleck hatte Hypothese aufgestellt, wie es Protonenpumpen durch den V-ATPasen, um einen stationären Zustand vesikulären pH aufrechtzuerhalten leichen. Das Ziel dieser visuellen Gegenstand (i), ein Verfahren, das die genetische Selektion von Zelllinien, die solche vesikuläre Transporter an ihrer Plasmamembran zu exprimieren, und (ii) an zwei unabhängige Ansätze, um die Funktionen dieser Transporter messen zeigen ermöglicht demonstrieren.
Vor drei Jahrzehnten Pouysségur und Franchi eine genetische Ansatz, der die molekulare Klonierung und Charakterisierung der Mitglieder der NHE Familie 15 aktiviert voran. Dies wurde auf die Toxizität von intrazellulärem Protonen als Screening Methode. Der erste Schritt war, um Zelllinien zu erhalten defizientenjeden Na + / H + -Austausch ausgedrückt in der Plasmamembran mit Hilfe der Reversibilität dieses Transporters. Fibroblasten (CCL39-Zellinie) wurden mit Na + oder Li + vorgespannt und dann in einer sauren extrazellulären Mediums (pH 6,5) für 2 Stunden platziert. Dies führte zu dem Tod von Zellen, die einen funktionellen Na + / H + -Austausch zu aktivieren und auf die Auswahl von Antiporter-defizienten Zellen (PS120 Zellinie) 16. Wenn Bicarbonat-freiem Medium kultiviert werden, diese Zellen sind sehr empfindlich gegenüber akuten intrazellulären Ansäuerung. Infolgedessen wird die Expression eines beliebigen Funktionsprotonen Effluxmechanismen an der Plasmamembran positiv gewählt werden (siehe 17), wenn diese Zellen in akuten intrazellulären Ansäuerungen eingereicht. Solche Versauerung Techniken können verwendet werden, um Zelllinien mit Handel Defekte ermöglicht die erzwungene Expression von WT intrazellulären NHEs an der Plasmamembran zu isolieren.
Als eukaryontische Na + / H+ Tauscher sind elektro, sie sind nicht messbar durch die elektrophysiologische Ansätze, die mit großem Erfolg eingesetzt worden sind, um Kanäle zu messen. Dieses Manuskript daher demonstriert, wie die Aktivität dieses Tauscher durch intrazelluläre pH-Messungen und schnelle Kinetik der Lithiumaufnahme messen. Da die zugrunde liegenden Konzepte die gleichen sind, ist es interessant zu bemerken, daß viele der für den Auswahlabschnitt entwickelten Verfahren auch direkt für die funktionelle Messungen verwendet.
Interessanterweise haben wir festgestellt, dass der Menschenhandel Defekt in der Zelllinien mit Hilfe der in dieser Handschrift beschriebenen Ansatz gewählt vorhanden führt zu einer größeren Expression von anderen vesikulären Proteine an der Plasmamembran wie der vesikulären Kaliumkanal TWIK1 18. Dies weist darauf hin, in Richtung auf die Auswahl einer allgemeinen Retentionsdefektmechanismus vesicularis Transmembranproteine. Daher ist diese Auswahlverfahren und die Zellen, die es generiert Maistellen ein vielversprechendes Werkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft der Arbeit an den Membranproteinen von intrazellulären Kompartimenten. Sowie die Messtechnik hier vorgestellten könnten anwendbar für die Untersuchung anderer nicht-elektroTransporter sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen, die intrazelluläre Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran, ohne dass ihre Primärsequenz durch ortsgerichtete Mutagenese ausgewählt. Diese Austauscher kann nun charakterisiert werden.
Dieses Verfahren basiert auf der zellulären Toxizität von intrazellulärem Protonen basierend auf Zelllinien, die vesikulären Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran exprimieren wählt. Es könnte möglich sein, i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
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