Функциональная характеристика Na<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> Теплообменники внутриклеточных отсеках с помощью Протон-убивает Выбор выразить их в плазматической мембране
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
Эндосом подкисление имеет решающее значение для широкого диапазона процессов, таких как переработка белка и деградации, рецептора десенсибилизации и нейромедиаторов нагрузке в синаптических пузырьках. Это подкисление описано быть опосредовано протонных АТФаз, в сочетании с CLC транспортеры хлорида. Высоко-сохраняется электронейтральных протоны перевозчиков, Na + / H + теплообменник (NHE) 6, 7 и 9 также выражены в этих отсеках. Мутации в генах были связаны с человеческими когнитивных и нейродегенеративных заболеваний. Как это ни парадоксально, их роли остаются неизвестными, так как их внутриклеточная локализация помешала подробного функционального характеристику. Эта рукопись показывает способ, чтобы решить эту проблему. Он состоит из отбора мутантных клеточных линий, способных выдерживать острую цитозольного подкисление с сохранением внутриклеточного NHEs на плазматической мембране. Затем изображает две дополнительные протоколы для измерения ионов селективность и активностьэтих теплообменников: (I), основанный на измерениях внутриклеточных рН с помощью флуоресцентной видеомикроскопия, и (II), выполненный на базе быстрой кинетики поглощения лития. Такие протоколы могут быть экстраполированы на другие измерения, не электрогенных транспортеры. Кроме того, процедура отбора, представленные здесь формирует клетки с фенотипом дефектного внутриклеточного хранения. Таким образом, эти клетки также выразить другие везикулярного мембранные белки в плазматической мембране. Поэтому стратегия эксперимента изображены здесь может представлять собой потенциально мощный инструмент для изучения других внутриклеточных белков, которые затем будут высказанные на плазматической мембране вместе с везикулярного Na + / H + теплообменники, используемые для отбора.
Introduction
Большинство внутриклеточных отсеков отображения кислую просвета рН, что является ключевым параметром для созревания, торговли, переработки белков и гормонов и нейротрансмиттеров Загрузка. Было показано, что рН градиент между цитозоле и везикулярной содержания генерируется вакуоли H + АТФазы 1, соединенный с везикулярных CLC хлорида транспортеров 2. И в нокаут (KO) мышей и больных людей, важность этих перевозчиков было выделено тяжелых фенотипов, вызванных мутациями в генах 3-6.
Члены натрий-водородного обменных SLC9A семьи, также называемый NHEs для Na + / H + теплообменников, как было показано, являются ключевыми эффекторами в внутриклеточного рН и регулирования объема клеток, а также в транспортной векторное кислотно-основных эквивалентов по эпителии , Кроме того, в плазматической мембране NHEs, три очень сохраняется Na + / H + теплообменники, NHE 6, 7и 9 выражены в транс-Гольджи сеть и в ранних эндосом 7. Мутации в генах были связаны с Angelman-как или Christianson Синдромы 8-9 семьи на основе аутизма 10 и дефицита внимания с гиперактивностью 11-12. Эти теплообменники также принимали участие в нейродегенеративных проблем, таких как болезнь Альцгеймера восприимчивости 13 и Х-хромосомой умственной отсталостью смежных генов синдромов 14. Взятые вместе, эти исследования подчеркивают важность этих внутриклеточных NHEs в развитии и / или функции головного мозга.
Внутриклеточная локализация этих теплообменников позволяет точные измерения их ионов селективности, направление транспортировки, кинетические параметры и регулирования. Как и в случае для всех перевозчиков, выраженных в внутриклеточных отсеков, крайне трудно оценить их биохимические деятельности и, следовательно, в полной мере понять свои физиологические функции и Mechanизмы лежащие в основе их патологические последствия. Основываясь на высокой цитозольным концентрации K +, наиболее общепринятым гипотеза, что они работают как K + в сочетании протонов отток перевозчиков. Существование такой утечки протонов были предположили, что это может уравновесить протонного накачки по V-АТФазы, с тем, чтобы поддерживать в стационарном состоянии везикулярного рН. Целью этой статьи является визуальной (I), чтобы продемонстрировать способ, который позволяет генетический выбор клеточных линий, которые экспрессируют такие везикулярных транспортеров на их плазматической мембране, и (II), чтобы показать два независимых подхода для измерения функции этих транспортеров.
Три десятилетия назад, Pouysségur и Франки были пионерами генетический подход, который позволил в молекулярное клонирование и характеристика членов семьи NHE 15. Это было основано на токсичность внутриклеточных протонов в качестве скринингового метода. Первым шагом было получение клеточных линий с дефицитомв любом Na + / H + обмена выражены в плазматической мембране, используя обратимость этого транспортера. Фибробласты линии (CCL39 клеток) были с предустановленной Na + или Li +, а затем помещают в кислой внеклеточной среде (рН 6,5) в течение 2 ч. Это привело к смерти клеток, экспрессирующих функциональный Na + / H + обмена и к выбору антипортера-дефицитных клеток (линия PS120 клетки) 16. При культивировании в бикарбоната свободной среде, эти клетки очень чувствительны к острой внутриклеточного подкисления. Следовательно, выражение любого функционального механизма протон оттока в мембране будет положительно выбран (см 17), если такие клетки представляются острых внутриклеточных acidifications. Такие методы подкисления можно использовать для выделения клеточных линий с торговлей дефекты, позволяющие принудительного экспрессии дикого типа внутриклеточных NHEs на плазматической мембране.
Как эукариотической Na + / H+ Теплообменники электронейтральна, они не поддаются оценке с помощью электрофизиологических методов, которые были использованы с большим успехом для измерения каналов. Эта рукопись поэтому демонстрирует, как для измерения активности этого теплообменника внутриклеточными измерений рН и быстрых кинетики поглощения лития. Как основные понятия же, интересно отметить, что многие процессы, разработанные для раздела выбора также используются непосредственно для функциональных измерений.
Интересно, что мы обнаружили, что дефект оборот присутствует в клеточных линий, выбранных с помощью подхода, описанного в этой рукописи приводит к большей экспрессии других везикулярных белков на плазматической мембране, например, везикулярного калиевого канала TWIK1 18. Это указывает на то, к выбору генерального механизма дефектов хранения для везикулярного трансмембранных белков. Следовательно, это процедура отбора, и клетки, которые он генерирует маяпредставляют собой перспективный инструмент для научного сообщества, действующего на мембранных белков внутриклеточных отсеков. Как и методы измерения, представленные здесь, могут быть применимы для изучения других не электрогенных перевозчиков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает, как выбрать клетки, экспрессирующие внутриклеточного Na + / H + обменники на плазматической мембране без изменения их первичной последовательности путем сайт-направленного мутагенеза. Эти теплообменники теперь могут быть охарактеризованы.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse – an animal model for Dent’s disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer’s disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
