Funktionel karakterisering af Na<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> Exchangers af intracellulære Rum Brug Proton-drab Selection at udtrykke dem på plasmamembranen
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
Endosomale forsuring er kritisk for en lang række processer, såsom protein genanvendelse og nedbrydning, receptor desensibilisering og neurotransmitter lastning i synaptiske vesikler. Denne forsuring er beskrevet at være medieret ved proton ATPaser koblet til CLC klorid transportører. Meget-konserverede elektroneutrale protoner transportvirksomheder, er Na + / H + vekslere (NHE) 6, 7 og 9 også til udtryk i disse rum. Mutationer i deres gener er blevet forbundet med humane kognitive og neurodegenerative sygdomme. Paradoksalt nok deres roller forblive undvigende, da deres intracellulære lokalisering har forhindret detaljeret funktionel karakterisering. Dette håndskrift viser en metode til at løse dette problem. Denne består af udvælgelse af mutante cellelinier, der er i stand til at overleve akut cytosoliske forsuring ved at bevare intracellulære NHE'er på plasmamembranen. Derefter viser to komplementære protokoller til at måle ion selektivitet og aktivitetdisse vekslere: (i) en baseret på intracellulære pH-målinger under anvendelse af fluorescens video mikroskopi, og (ii) den ene baseret på hurtige kinetik af lithium-optagelse. Sådanne protokoller kan ekstrapoleres til at måle andre ikke-elektrogen transportører. Desuden udvælgelsesproceduren præsenteres her genererer celler med en intracellulær tilbageholdelse defekt fænotype. Derfor er disse celler også udtrykker andre vesikulære membranproteiner på plasmamembranen. Den eksperimentelle strategi afbildet her, kan derfor udgøre et potentielt stærkt værktøj til at studere andre intracellulære proteiner, der vil blive derefter udtrykt på plasmamembranen sammen med vesikulær Na + / H + vekslere anvendes til valg.
Introduction
De fleste intracellulære rum viser en sur luminale pH, som er en vigtig parameter for modning, menneskehandel, genanvendelse af proteiner eller hormoner og neurotransmittere loading. Det er blevet vist, at pH-gradienten mellem cytosol og vesikulær indhold genereres af vakuolær H + ATPaser 1 koblet til vesikulære CLC klorid transportører 2. Både i knock-out (KO) mus og humane patienter, er betydningen af disse transportører blevet fremhævet af de tunge fænotyper forårsaget af mutationer i deres gener 3-6.
Medlemmerne af natrium-hydrogen vekslere SLC9A familie, også kaldet NHE'er for Na + / H + vekslere, har vist sig at være vigtige effektorer i intracellulær pH og regulering cellevolumen samt i vectorial transport af syre-base ækvivalenter tværs epitel . Udover plasma membran NHE'er, tre højkonserveret Na + / H + vekslere, NHE 6, 7og 9 er udtrykt i trans-Golgi netværket, og i begyndelsen af endosomer 7. Mutationer i deres gener har været forbundet med Angelman-lignende eller Christianson syndromer 8-9, familiebaseret autisme 10 og Attention Deficit Hyperactivity Disorder 11-12. Disse vekslere har også været involveret i neurodegenerative problemer såsom Alzheimers sygdom modtagelighed 13 og kønsbunden mental retardering tilstødende gener syndromer 14. Tilsammen fremhæve disse undersøgelser betydningen af disse intracellulære NHE'er i hjernens udvikling og / eller funktion.
Den intracellulære lokalisering af disse vekslere forhindrer nøjagtige målinger af deres ion selektivitet, retning transport, kinetiske parametre og regulering. Som det er tilfældet for alle transportvirksomheder udtrykt i intracellulære rum, er det yderst vanskeligt at vurdere deres biokemiske aktiviteter og dermed til fuldt ud at forstå deres fysiologiske roller og den mechanismer underliggende deres patologiske konsekvenser. Baseret på den høje cytosoliske K + koncentration, mest almindeligt accepteret hypotese var, at de arbejder som K + koblede proton effluxtransportører. Eksistensen af en sådan proton lækage var blevet antaget, da det kan opveje proton pumpning af de V-ATPaser for at opretholde en steady state vesikulær pH. Formålet med denne visuelle artikel er (i) at påvise en fremgangsmåde, som tillader genetisk udvælgelse af cellelinier, som udtrykker sådanne vesikulære transportere på deres plasmamembran, og (ii) for at vise to uafhængige fremgangsmåder til at måle funktioner af disse transportører.
Tre årtier siden, Pouysségur og Franchi har været banebrydende for en genetisk tilgang, gjorde det muligt for molekylær kloning og karakterisering af medlemmerne af NHE familien 15. Dette var baseret på toksiciteten af intracellulære protoner som en screeningsmetode. Det første skridt var at få cellelinier mangelfuldei en Na + / H + udveksling udtrykt på plasmamembranen ved hjælp af reversibiliteten af denne transportør. Fibroblaster (CCL39 cellelinie) blev indlæst med Na + eller Li + og derefter placeret i et surt ekstracellulære medium (pH 6,5) i 2 timer. Dette førte til døden af celler, der udtrykker en funktionel Na + / H + udveksling og til udvælgelse af antiporter-deficiente celler (PS120 cellelinie) 16. Når dyrket i bicarbonat-medium, disse celler er meget følsomme over for akut intracellulær forsuring. Følgelig vil ekspression af enhver funktionel proton udstrømningsmekanisme på plasmamembranen positivt valgt (se 17), hvis sådanne celler indgives akutte intracellulære acidifications. Sådanne forsuring teknikker kan anvendes til isolering af cellelinier med trafficking fejl muliggør tvungen ekspression af WT intracellulære NHE'er på plasmamembranen.
Som eukaryot Na + / H+ Vekslere er elektroneutrale, er de ikke måles ved de elektrofysiologiske metoder der har været anvendt med stor succes til at måle kanaler. Dette håndskrift viser derfor, hvordan man måler aktiviteten af dette veksler med intracellulære pH-målinger og hurtige kinetik af lithium optagelse. Da de underliggende begreber er den samme, er det interessant at bemærke, at mange af de processer, der er udviklet for udvælgelsen afsnittet også anvendes direkte til funktionelle målinger.
Interessant nok har vi observeret, at defekt trafficking stede i cellelinier udvalgt ved hjælp af metoden beskrevet i dette manuskript fører til en større ekspression af andre vesikulære proteiner ved plasmamembranen såsom vesikulære kaliumkanal TWIK1 18. Dette peger ud mod valget af en generel tilbageholdelse defekt mekanisme for vesikulær transmembrane proteiner. Derfor denne udvælgelsesprocedure, og de celler, den skaber majudgør et lovende redskab for det videnskabelige samfund arbejder på membranproteiner fra intracellulære rum. Samt de målemetoder, der præsenteres her kunne finde anvendelse for at studere andre ikke-elektrogen transportører.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man vælge celler, der udtrykker intracellulært Na + / H + varmevekslere på plasmamembranen uden at ændre deres primære sekvens ved stedrettet mutagenese. Disse vekslere kan nu karakteriseres.
Denne metode er baseret på den cellulære toksicitet af intracellulære protoner at vælge cellelinier, vil udtrykke vesikulær Na + / H + varmevekslere på plasmamembranen. Det er måske muligt i princippet at bruge and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse – an animal model for Dent’s disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer’s disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
