وحجم صغير الأحيائي لتقييم البكتيرية / العوالق النباتية المشارك الثقافة عن طريق WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) التألق
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
الأساليب التقليدية للتلاعب التجريبية من الطحالب قد استخدمت كميات كبيرة من الثقافة (20 مل إلى 5 L)، بحيث يمكن subsampled الثقافة في كافة مراحل التجربة 1-7. الاختزال كميات كبيرة يمكن أن يكون مشكلة لعدة أسباب: 1) أنه يسبب التغير في إجمالي حجم ومساحة السطح: نسبة حجم من الثقافة خلال التجربة. 2) الزائفة التكرار (أي تكرار عينات من نفس المعاملة قارورة 8) وغالبا ما يعملون بدلا من مكررات الحقيقية (أي أخذ العينات من العلاجات تكرار)؛ 3) مدة التجربة محدودة على مجموع الحجم؛ و4) الثقافات ممحوضة أو الجراثيم البكتيرية المعتادة هي صعبة للحفاظ خلال تجارب طويلة الأمد كما يحدث عادة خلال تلوث الاختزال.
استخدام لوحات عيار مكروي تمكن 1 مجلدات ثقافة مل لاستخدامها في كل تكرار، مع ما يصل إلى 48 العلاجات منفصلة داخلوسم لوحة 12.65 X 8.5 × 2.2، مما يقلل من حجم التجريبية والسماح للنسخ المتماثل واسعة دون الاختزال أي علاج. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية يمكن تعديلها لتناسب مجموعة متنوعة من الأشكال التجريبية من بينها: البكتيري-الطحالب المشترك الثقافات، والاختبارات الطحالب علم وظائف الأعضاء، والسم فحص 9-11. الآبار الفردية مع طحلب، بكتيريا و / أو زملاء الثقافات يمكن أخذ عينات للعديد من الإجراءات المخبرية بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر: WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) التألق، المجهري، مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدة (وت) التهم والتدفق الخلوي. مزيج من شكل وحة microtiter وWATER-PAM التألق يسمح للقياسات السريعة متعددة من العائد الضوئي والمعلمات الضوئية الأخرى مع تقلب منخفض بين العينات، استنساخ عالية ويتجنب الكثير من المزالق من الاختزال والدامجانة زجاجة أو قارورة مخروطي الشكل على مدار التجربة .
Introduction
وقد جرت العادة على درس علم وظائف الأعضاء العوالق النباتية في التجارب المتوسط على نطاق واسع من 20 مل في قوارير المخروطية إلى 5 لتر في قوارير 1-7. هذا على نطاق تجريبي يتطلب الاختزال لرصد التجريبي، كما التضحية عينات تكرار لكل نقطة زمنية يخلق الإعداد التجريبية لا يمكن السيطرة عليها.
القدرة على زيادة عدد تجارب مستقلة أثناء استخدام نفس المساحة حاضنة نهاري من قبل التصغير حجم التجريبي للتجارب فسيولوجيا الطحالب سوف تخفيض أو إزالة القيود المفروضة على الاختزال والزائفة النسخ المتماثل من كميات كبيرة. وقد تم تطوير شكل وحة microtiter لاختبارات بيولوجية الطحالب باستخدام حجم 1 مل الثقافة تجريبيا لمعالجة الطحالب في ظروف متغيرة. يسمح هذا الحجم تجريبي صغير لعدد من مكررات إلى أن زيادة، ويزيد من استنساخ التجربة نظرا لتقلب انخفضت بين العينات تكرار والتجارب، ويسمح للنسخ المتماثل صحيح مع الحفاظ على الضوابط التجريبية (أي والثقافات الطحالب ممحوضة) لمدة 140 يوما (الشكل 2) 12.
ويتم تكييف هذا الشكل وحة microtiter بسهولة لمجموعة متنوعة من الأسئلة التجريبية، مثل: هل يمكن لأي بكتيريا يكون التفاعل التكافلية، محايد أو الممرضة مع مضيفه الطحالب؟ هو إضافة لتحفيز مجمع أو سامة إلى طحلب؟ هذه الأسئلة وغيرها لا يمكن معالجتها بطريقة عالية الإنتاجية السريعة باستخدام هذا الشكل الجديد 9-11.
A 48-جيدا لوحة الثقافة عيار مكروي تتيح لكل 1 مل جيدا ليكون الإعداد التجريبية المستقلة التي تم أخذ عينات في واحدة الوقت نقطة. يمكن أخذ عينات المعلمات المختلفة من هذا المجلد 1 مل بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على: مضان الكلوروفيل والمعلمات الضوئية باستخدام WATER-نبض السعة التضمين (WATER-PAM) قياس التألق (انظر المواد والمعدات الجدول) 13. WATER-PAM التألق هو تقنية سريعة وغير الغازية التي يمكن استخدامها لمراقبة التجارب أجريت مع الطحالب 13. وهو يتيح قياس كفاءة التمثيل الضوئي والصحة PSII من حجم صغير الثقافة (150-300 ميكرولتر من ثقافة المخفف في المتوسط إلى 2 – حجم مل 4 لWATER-PAM) 14،15. بالإضافة إلى WATER-PAM التألق، وهذا الإعداد يمكن استخدامها لقياس مجموعة متنوعة من العوامل الأخرى بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على: الفحص المجهري لتصور البكتيريا التي تعلق على خلايا الطحالب والتغيرات في مورفولوجيا الخلايا الطحلبية. مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدة (وت) التهم الموجهة إليه. والتدفق الخلوي لعدد خلايا الطحالب وتحديد المجموعات السكانية الفرعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نمو الطحالب في شكل المنمنمة.
التصغير من الثقافات الطحالب إلى وحدة تخزين الثقافة 1 مل في وحة microtiter يسمح لتكرار ضمن تجربة لتكون زيادة. من المهم لضمان طحلب هو صحي طوال تجربة. إجراء منحنى النمو (الشكل 2)، وذلك باستخدام صيغة وحة mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
