En liten volym Bioanalys att Bedöm Bakteriell / Växtplankton Co-kultur Använda WATER-Pulse-amplitudmodulerad (WATER-PAM) fluorometri
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
Konventionella metoder för experimentell manipulering av mikroalger har utnyttjat stora volymer av odling (20 ml till 5 L), så att odlingen kan delsamplas under experimentet 1-7. Delsampling av stora volymer kan vara problematisk av flera skäl: 1) det orsakar variation i den totala volymen och ytarean: volymförhållande av kulturen under experimentet; 2) pseudo-replikering (dvs, replikera prover från samma behandlingskolven 8) ofta används i stället för riktiga replikat (dvs, provtagning från upprepade behandlingar); 3) att hela experimentet begränsas av den totala volymen; och 4) axenisk kulturer eller den vanliga bakteriefloran är svåra att upprätthålla under långtidsförsök som kontaminering sker vanligen under delstickprov.
Användningen av mikrotiterplattor möjliggör 1 ml kulturvolymer som skall användas för varje replikera, med upp till 48 separata behandlingar inomen 12,65 x 8,5 x 2,2 cm platta och därmed minskar den experimentella volymen och möjliggör omfattande replikering utan subsampling någon behandling. Dessutom kan denna teknik modifieras för att passa en mängd olika experimentella format inklusive: bakteriellt-algal samkulturer, alger physiology tester och toxin screening 9-11. Enskilda brunnar med en alg, bakterie och / eller co-kulturer kan samplas för många laboratorieförfaranden inklusive, men inte begränsat till: VATTEN-Pulse-amplitudmodulerad (WATER-PAM) fluorometri, mikroskopi, bakteriekolonibildande enhet (CFU) räknas och flödescytometri. Kombinationen av mikrotiterplattformat och VATTEN PAM fluorometri tillåter flera snabba mätningar av fotokemisk avkastning och andra fotokemiska parametrar med låg variabilitet mellan prover, hög reproducerbarhet och undviker de många fallgropar delstickprov en damejeanne eller konisk kolv under loppet av ett experiment .
Introduction
Växtplankton fysiologi har traditionellt studerats i meso skaleförsök från 20 ml i koniska kolvar till 5 L i dunkar 1-7. Denna experimentella skala kräver subsampling för experimentell övervakning, så offra replikatprover för varje tidpunkt skapar en ohanterlig experimentuppställning.
Förmågan att öka antalet oberoende försök medan du använder samma dygns inkubatorn utrymme genom miniatyrisera den experimentella volym för alger fysiologiska experiment kommer att minska eller eliminera de begränsningar av subsampling och pseudo replikering från stora volymer. En mikrotiterplattformat har utvecklats för alger bioanalyser med en 1 ml odlingsvolym för experimentellt manipulera alger i varierande förhållanden. Denna lilla experiment volymen gör att antalet replikat ökas, ökar experimentell reproducerbarhet på grund av en minskad variabilitet mellan replikatprover ochexperiment och tillåter sann replikering bibehållen experimentella kontroller (dvs. axenisk alger kulturer) för 140 dagar (Figur 2) 12.
Denna mikrotiterplattformat är lätt anpassas för en mängd olika experimentella frågor, till exempel: gör en bakterie har ett symbiotiskt, neutral eller patogen interaktion med sin alger värd? Är tillsatsen av en förening stimulerande eller toxiska för en alg? Dessa och andra frågor kan behandlas i en snabb hög genomströmning sätt att använda denna nya formatet 9-11.
En 48-brunnars mikrotiterplatta med odlingsplatta tillåter vardera 1 ml väl att vara en oberoende försöksuppställning som samplas vid en enda tidspunkt. Olika parametrar kan samplas från 1 ml volym inklusive, men inte begränsat till: klorofyllfluorescens och fotokemiska parametrar använder WATER-Pulse-amplitudmodulerad (WATER-PAM) fluorometri (se Material och utrustning tabell) 13. WATER-PAM fluorometri är en snabb och icke-invasiv teknik som kan användas för att övervaka experiment utförda med alger 13. Den tillåter mätning av foto effektivitet och PSII hälsa från en liten odlingsvolym (150-300 pl kultur utspätt i medium till en 2-4 ml volym för WATER-PAM) 14,15. Förutom vatten-PAM fluorometri, kan denna inställning användas för att mäta en mängd olika andra parametrar, inklusive, men inte begränsat till: mikroskopi för att visualisera bakterierna knutna till algceller och förändringar i algceller morfologi; bakteriekolonibildande enhet (cfu) räknas; och flödescytometri för alger celler och identifiera subpopulationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algtillväxt i en miniatyriserad format.
Miniatyriseringen av alg- kulturer till en 1 ml odlingsvolym i en mikrotiterplatta medger replikering inom ett experiment för att ökas. Det är viktigt att säkerställa att algen är frisk hela ett experiment; utföra en tillväxtkurva (figur 2), med hjälp av mikrotiterplattformat att bedöma olika alger medier, för att säkerställa näringsbehov algen uppfylls. Dessutom kan det vara viktigt att optimera dygnscykel (ljusa och mörk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
