높은 처리량의 사용<em> 체외</em> 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는
Summary
이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.
Abstract
일반적으로 생체 내에서 검출 경구 생물막 다수 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을 촉진 시험 관내 시스템에서의 약간 높은 처리량이있다. 또한, 인공 대신 미디어, 영양원으로서 천연의 사람의 타액을 사용하는 시스템은, 생체 모방 커뮤니티 셀룰러 및 생물막 별 속성의 표현을 지원하기 위해 특히 바람직하다. 우리는 인간 구강 유사한 조건 하에서, 치은 연상 치석을 위해 종 조성물에 대하여, 비교 가능한 멀티 종 경구 생물막의 개발을위한 방법을 설명한다. 특히,이 방법은 문서 시판 마이크로 유체 시스템이 멀티 – 유래의 종 경구 생물막의 개발을 용이하게하도록 적응 풀링 타액 내 성장시킬 수있는 방법을 설명한다. 더욱이, 방법은 시스템의 설명 confoca와 함께 사용될 수있다L 레이저 스캐닝 현미경 표시됩니다 건축과 생존 분석을위한 3-D 생물막 복원을 생성합니다. (연쇄상 구균, 나이 세리아, Veillonella, Gemella 및 포피 포함) 미세 유체 시스템에서 바이오 필름 내에서 성장하는 미생물의 넓은 다양성을 감안할 때, 프로토콜은 또한 더 하위 문화 또는 DNA 추출 및 분석을위한 생물막 세포를 수확하는 방법에 대한 표시됩니다. 미세 유체 생물막 시스템과 현재의 최첨단 데이터 분석 모두의 한계는 해결 될 것입니다. 궁극적으로,이 문서가 구강 생물막 (biofilm)의 연구를 개선하고 미세 유체 플랫폼과 통합 할 수있는 추가 기술의 개발에 도움이 될 기본 기술을 제공 할 것으로 상상된다.
Introduction
바이오 필름은 구조적으로 표면 일에 집계 박테리아의 복잡한 사회입니다. 이 사회는 일반적으로 바이오 필름이 내 서로 상호 작용하는 수많은 종을 포함하고있다. 구강 바이오 필름, 시각적으로 가장 눈에 띄는되는 치석은, 인간의 지속적인 문제 및 분류 학적으로 다양한 멀티 종 커뮤니티 3 세대에서의 통제되지 않은 개발 결과입니다. 이러한 다양한 지역 사회의 구성 요소 박테리아는 자신의 자유 부동 (플랑크톤)의 대응 4-6 이상의 항생제에 대한 저항력 1,000 배까지 될 수 있습니다. 미국에서 연간 치과 의사 사무실에 5 억 방문하고, 약 108,000,000,000달러는 치료 또는 치주을 방지하기 : 치아 우식증과 치주 질환을 일으킬 수있는 이러한 구강 생물막 지역 사회를 치료하지 않을 경우, 상당한 공중 보건 부담을 초래하고있다 질환과 충치 7.
어려움을 극복하기위한 그들의 사기가 지속적으로 실험실 문화 작업의 매력적인 용이성. "(8) – 스미스에 의해 약화되어 있기 때문에 내용은"> "많은 미생물이 자연 상태에서 미생물 동작을 공부 옹호하는 동안, 그들 중 몇 그렇게.입니다.현재, 구강 생물막 연구가 생체 내 및 생체 외 접근의 다양한 사용하여 수행되는, 자신의 장점과 각각 9,10 불리. 시험관이 자주 설정 비교적 용이하지만 임상 부족할 수있다 모델 생물막 시스템을 사용하는 접근 / 실제 관련성 (10, 11). 생체 내 접근 방식은 일반적으로 인간의 구강 환경의 특정 측면을 재현, 그러나 다시 제한으로 고통 때문에 동물 사이의 해부학, 생리학, 미생물학 및 면역학의 차이로 12 인간이 할 수있다 동물 모델 시스템에 의존, (13). 그것은 구강 생물막 주목해야한다또한 인간 자원 봉사자의 입을 내 스텐트에서 개최 에나멜 표면에 개발,하지만이 방식은 현재 상대적으로 비용이 많이 들고 노동 집약적 인 14, 15입니다 수 있습니다. 궁극적으로, 새로운 제 또는 구강 건강을 개선하는 기술은 임상 시험 조건 (11)에서 인간 시험한다. 현재, 새로운 구강 건강 관리 에이전트를 식별하고 평가하는 자주 사용하는 수법은 첫 번째 실험 연구는 잠재적 인 효과를 식별 한 다음 동물 연구 및 기술 (9)의 성공을 평가하기 위해 임상 사용 "현장 시험"을 수행하기 위해 수행하는 것입니다, 16, 17. 불행하게도, 실험실 연구는 큰 공간을 차지 모델 시스템에 의존하는 경향이 사용하기 기술적으로 도전하고, 자주 10,18 의미 잠재적 인 실제를 유도하기 위해 몇 종 하나 또는 최대 커뮤니티를 단순화가 들어 있습니다. 치석 바이오 필름이 COMPL에서 여러 종의 형태를 포함하는 점을 감안EX 인공 미디어 실제 시나리오 10,19에서와 유사한 방식으로 동작 공동체를 생성 할 가능성이 하나를 포함 생물막 또는 몇 종의 개발, 환경 타액 흐르는. 시간, 비용, 트레이닝 요구 사항, 실제 환경에 비해 실험실 모델 생물막 시스템의 빈약 대표성을 해결하기 위해, 우리는 최근 높은 처리량 및 환경 게르만 생물막 시스템 (20) (도 1)를 개발 하였다. 접종 등의 중간 처리되지 않은 풀링 인간의 박테리아 세포 함유 타액 (CCS) 등의 무 세포 풀링 된 인간의 타액 (CFS)의 사용으로 시스템의 혜택을 제공합니다. 유일하게, 시스템은 미세 유체 기술, 공 초점 레이저 주사 현미경, 및 세균 배양 독립적 다양성 분석 기술을 결합한다. 따라서, 모델 시스템은 접종 37 종 멀티 생물막을 성장 환경으로 게르만 (사용 타액이다 필터 살균이 흐르는 C를 °타액)과 구강 바이오 필름은 초기 치은 연상 치석 (20)에서 발견의 풍부함 대표의 연쇄상 구균, 나이 세리아, Veillonella 및 포피 종을 포함하여 종 ()가 포함되어 있습니다.
이 작품은 새로 개발 된 모델 시스템의 사용을 설명하는 고려할 때 특히주의가 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 미세 유체의 융합, 문화 독립적 인 다양성 분석 기술에 부여해야합니다. 우리의 연구 그룹에 의해 이러한 기술의 조합은 의도적이고뿐만 아니라 새로 개발 된 모델 시스템에 높은 처리량 기능을 추가 할뿐만 아니라 질문에 쉽게 다른 시스템과 이전에 해결 될 수 없다는 것을 질문 할 수 있습니다. 이 바이오 필름의 3 차원 분석을 가능으로 첫째, CLSM은 기존의 현미경을 통해 뚜렷한 장점이 있습니다. 바이오 필름은 이기종 재치이기 때문에 종종 진가를 인정받지 못한,이 매우 중요하다H 종 조성물 및 공간적 위치에 대해서뿐만 아니라 생리 학적 조건은 6,21 바이오 필름 내의 상이한 공간 위치에 부과된다. 입체 렌더링 소프트웨어 및 이미지 분석 소프트웨어, 생물막 구조, 구성 요소 사이의 공간 관계 종 및 미생물 사멸의 정도와 협동하여 22-24을 분석 할 수있다. 이러한 능력은 표준 투과광 또는 표면 형광 현미경을 사용하여 불가능합니다. 주의 깊게 통제 된 조건 (유량, 온도, pH 등)에서 바이오 필름의 연구를 가능하게하고 만 액체 25-27의 작은 볼륨을 필요로 다음, 미세 유체 미생물학 분야에 특별한 관심을 얻고있다. 그 달성으로 비교 점으로, 비슷한 유량 및 전단에 20 시간 동안 흐름 셀 모델 시스템 (틀림없이 많은 구강 생물막 연구를위한 주력 모델로 간주되는 시스템) 내에서 인간의 타액에서 구강 생물막 성장미세 유체 소자 28-31 800 μL 대조적으로 마이크로 유체 시스템에서, 적어도 200 mL로 요구한다. 따라서, 미세 유체 모델 생물막 시스템은 정의 된 조건에서 수량 제한 물질의 연구를 할 수 있습니다. 마지막 pyrosequencing 기법 기술은 사회 분석을 수행하는 물질의 소량 만이 필요하도록 지난 10 년 최적화에도 희소 생물막 종의 ID를 획득하기 위해 시퀀스의 깊이를 제어하도록 충분히 다재다능되었다. 세균성 태그 인코딩 FLX 앰플 리콘 pyrosequencing 기법 (bTEFAP) 등이 기술의 사용은, 생물막의 생태에 관한 관련 질문에 대한 허용했다가 (32, 33)를 해결해야합니다. 이러한 질문은 pyrosequencing 기법 이유로 인해 시간과 플라스미드 라이브러리 및 데이터 (33, 34)를 도출하는 데 필요한 복잡한 기술 및 분석 단계를 작성하는 데 필요한 비용을 사용할 수없는 과거에 어려움을 고취. 문화 독립적 인 AP와 물론 큰 장점이러한 pyrosequencing 기법으로 proaches는, 기존의 실험실 미디어 (즉, 실행 가능한하지만 비 경작 종) 내에서 독립적으로 성장 할 수없는 종의 박테리아가 성장 식별 모델 시스템 내에서 그리고 지역 사회에서의 상대적인 풍부, 36 (35)를 정량화 할 수 있다는 것입니다 . 이르면 1963과 같은 관점을 추가하려면, 후반 지그문트 Socransky은 인간의 구강 잇몸 틈새에서 분리 된 물질에서 박테리아의 약 50 %가 실험실 성장 조건 (37)를 사용하여 배양 할 수 없다고 추정했다.
이 방법 용지의 목적은 시판중인 마이크로 유체 (Bioflux) 시스템에서의 경구 다중 종 생물막을 개발하는 방법을 설명하는 것이다 : (I) 조건 인간 구강 대표 및 (II) 종의 조성 및 풍부 그 치은 연상 치석 비교입니다. 또한, 모두 프리웨어 및 상용 소프트웨어를 사용하여, 우리는 어떻게 기본 생물막을 강조아키텍처 조치가 생물막 바이오 매스, 조도 및 생존 능력을 정량화하는 방법에 중점을두고, CLSM 데이터로부터 유도 될 수있다 (라이브 / 죽은 얼룩에 따라). 마지막으로, bTEFAP에 의해 다양성 분석을위한 바이오 필름 재료를 수확하는 데 필요한 단계가 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법 용지 설정하는 데 필요한 기본 단계를 하이라이트 및 풀링 인간 타액에서 유래 필터 멸균 25 %의 풀링 된 인간 타액에서 재배 경구 다중 종 생물막의 개발을 허용하는 방식으로 마이크로 유체 시스템을 실행. 생물막을 특성화 방법들이 주어진다 있지만 이러한 설명 방식이, 예를 들어, 얼룩 또는 라벨을 도입 할 수있다, 등의 수정 및 추가 기술이라는 것을 기억해야한다. 예를 들어 말하자?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 생물막 성장 프로토콜과 존 바티스타 (Fluxion, 샌프란시스코, CA) Bioflux 시스템에 관한 기술적 인 문제에 관한 조언을 수립하는 데 도움을 윌리엄 낸스 (미시간 대학) 감사합니다. 창업 자금 AHR에 (AHR에 R21DE018820 NIH)와 미시간 대학이 작품은 국립 보건원에 의해 지원되었다
Materials
| SUPPLIES AND EQUIPMENT | AVAILABLE FROM COMPANY | CATALOG NUMBER |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 |
| Ultra Low Temperature Freezer -80°C | Multiple choices | Multiple choices |
| Tips (20, 200, and 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
| SOFTWARE | ||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | |
| Imaris | Bitplane | |
| Leica SPE | Leica | |
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | |
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | |
References
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