A utilização de uma alta taxa de transferência<em> In Vitro</em> Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

Summary

O objectivo deste trabalho é métodos para descrever o uso de um sistema de microfluidos para o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies que contêm espécies normalmente identificados na placa dental supragengival humano. Métodos para descrever arquitetura biofilme, a viabilidade de biofilme, e uma abordagem para a colheita de biofilme para análises dependentes de cultura ou independentes de cultivo são realçados.

Abstract

Há poucos de alto rendimento em sistemas in vitro que facilitam o desenvolvimento de biofilme multi-espécies que contêm numerosas espécies comumente detectados dentro in vivo biofilmes orais. Além disso, um sistema que utiliza a saliva humana natural como fonte de nutrientes, em vez de meios artificiais, é particularmente desejável de modo a suportar a expressão de propriedades celulares e específicos de biofilme que imitam as comunidades in vivo. Descreve-se um método para o desenvolvimento de multi-espécies biofilmes orais que são comparáveis, no que diz respeito à composição das espécies, a placa dental supragengival, sob condições semelhantes para a cavidade oral humana. Especificamente, este artigo descreve métodos como um sistema de microfluidos disponível comercialmente pode ser adaptada para facilitar o desenvolvimento de múltiplas espécies biofilmes orais derivadas e cultivadas dentro de saliva reunidas. Por outro lado, uma descrição de como o sistema pode ser utilizado em conjunto com um confocal microscópio de varredura a laser para gerar 3-D reconstruções biofilme para análises de arquitectura e de viabilidade será apresentado. Dada a grande diversidade de microrganismos que crescem dentro de biofilmes no sistema microfluídico (incluindo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella e Porphyromonas), um protocolo também será apresentado descrevendo como a colheita das células do biofilme para posterior subcultura ou extração de DNA e análise. Os limites tanto do sistema de biofilme microfluídicos e as análises de dados state-of-the-art atuais serão abordados. Em última análise, é previsto que este artigo irá fornecer uma linha de base técnica que vai melhorar o estudo de biofilmes orais e auxiliar no desenvolvimento de tecnologias adicionais que podem ser integrados com a plataforma de microfluidos.

Introduction

Os biofilmes são arquitetonicamente complexas comunidades de bactérias que são agregados em superfícies ^1. Estas comunidades geralmente contêm numerosas espécies que interagem uns com os outros dentro do biofilme ^2. Biofilmes orais, o mais visualmente notável sendo a placa bacteriana, são um problema persistente em seres humanos e os seus resultados para o desenvolvimento incontrolado de geração de taxonomicamente diversas comunidades multi-espécies ^3. As bactérias que compõem essas diversas comunidades pode ser de até 1.000 vezes mais resistentes aos antimicrobianos do que os seus (planctônicas) vias de livre flutuação ^4-6. A falta de tratamento destas comunidades do biofilme dental, que podem causar cárie dentária e doença periodontal, resultou em um encargo significativo de saúde pública: mais de 500 milhões de visitas ao consultório de dentista por ano em os EUA, e uma cerca de 108.000 milhões dólares para tratar ou prevenir periodontal doença cárie dentária e ^7.

content ">" Enquanto muitos microbiologistas defender o estudo do comportamento microbiano em condições naturais, alguns deles fazê-lo. Isto porque a sua moral para superar as dificuldades é constantemente solapada pela facilidade atraente de trabalhar com culturas de laboratório. "-Smith ^8.

Actualmente, a investigação biofilme bucal é realizada usando uma variedade de in vivo e in vitro abordagens, cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens ^9,10. In vitro abordagens costumam usar sistemas de biofilme modelo que são relativamente fáceis de configurar, mas podem faltar clínico / relevância no mundo real ^10,11. In vivo abordagens normalmente dependem de sistemas de modelos animais que podem reproduzir certos aspectos do ambiente oral humana, mas novamente sofrem de limitações devido a diferenças na anatomia, fisiologia, microbiologia e imunologia entre animais e humanos ^{12, 13.} Deve notar-se que os biofilmes oraistambém podem ser desenvolvidos em superfícies de esmalte, realizada em um stent dentro da boca dos voluntários humanos, mas esta abordagem é actualmente relativamente caro e ^14,15 de trabalho intensivo. Em última análise, novos agentes e tecnologias para melhorar a saúde bucal são testados em seres humanos em condições de ensaios clínicos controlados ^11. No momento, um modus operandi muito usada para identificar e avaliar novos agentes de saúde bucal é a primeira a realizar estudos de laboratório para discernir eficácia potencial, e, em seguida, realizar estudos com animais e os "testes de campo" que empregam os clínicos para avaliar o sucesso da tecnologia ^{9, 16,17.} Infelizmente, os estudos de laboratório tendem a confiar em sistemas modelo que ocupam uma grande pegada, são tecnologicamente difícil de usar, e muitas vezes contêm comunidades de um ou, no máximo, algumas espécies simplificado para derivar potencial do mundo real que significa ^10,18. Dado que o biofilme da placa dental conter várias espécies e em forma de quex fluir meio salivar, o desenvolvimento de biofilmes que contêm uma ou algumas espécies em é pouco provável para gerar comunidades que se comportam de um modo semelhante às de um cenário real ^10,19 meios artificiais. Para lidar com o tempo, custo, requisitos de formação, bem como a natureza representativa pobre de sistemas de biofilme modelo de laboratório em comparação com o ambiente do mundo real, que recentemente desenvolveu uma alta taxa de transferência e sistema de biofilme ambientalmente germane ²⁰ (Figura 1). Os benefícios do sistema a partir da utilização de livre de células saliva humana em pool (CFS) como meio e não tratada reunidas saliva contendo célula bacteriana humana (CCS) como inóculo. Excepcionalmente, o sistema também combina a tecnologia microfluídica, um microscópio confocal de varrimento laser e tecnologia de análise de diversidade bacteriana independente de cultura. Assim, o sistema de modelo é ambientalmente pertinente (usando saliva como um inoculo para crescer biofilmes multi-espécies a 37 ° C em esterilizada por filtração de fluxosaliva) e os biofilmes orais contêm espécies (incluindo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, e espécies de Porphyromonas) em abundâncias representativos dos encontrados no início de placa supragengival ^20.

Ao considerar que este trabalho descreve o uso do sistema de modelo recém-desenvolvido, deve ser dada especial atenção à fusão de um microfluidics microscopia confocal a laser (CLSM) e tecnologias de análise de diversidade independentes de cultivo. A união destas tecnologias por nosso grupo de pesquisa foi intencional e não só acrescenta uma capacidade de alto rendimento para o sistema modelo recém-desenvolvido, mas também permite perguntas a serem feitas que não poderia ser facilmente tratadas antes com outros sistemas. Em primeiro lugar, CLSM tem vantagens distintas em relação microscopia tradicional, uma vez que permite a análise tridimensional de biofilmes. Muitas vezes desvalorizado, isso é extremamente importante como biofilmes são sagacidade heterogêneoh relação à composição de espécies e posição espacial, bem como as condições fisiológicas sendo impostas em diferentes localizações espaciais dentro do biofilme ^6,21. Em conjunto com software tridimensional de renderização e software de análise de imagem, a arquitetura do biofilme, as relações espaciais entre as espécies que o compõem, e extensão da morte antimicrobiana pode ser analisado ^22-24. Tais habilidades não são possíveis com o padrão de luz transmitida ou microscopia de epifluorescência. Em seguida, a microfluídica já recebeu atenção especial no campo da microbiologia, pois permite o estudo de biofilmes sob condições cuidadosamente controladas (vazão, temperatura, pH, etc.) e requer apenas pequenos volumes de líquido ^25-27. Como ponto de comparação, crescimento de um biofilme oral na saliva humana dentro de um sistema modelo de célula de fluxo (um sistema que é considerado sem dúvida o modelo de esteio para muitos estudos do biofilme dental) por 20 horas a uma velocidade de fluxo semelhante e ao cisalhamento, em que alcançouem um sistema de microfluidos requer pelo menos 200 ml, em oposição aos 800 ul no dispositivo de microfluidos ^28-31. Assim, um modelo de sistema de microfluidos biofilme permite o estudo de materiais limitam-lote sob condições definidas. Finalmente, a tecnologia pyrosequencing foi otimizado na última década para exigir que apenas pequenas quantidades de material para realizar uma análise da comunidade e é suficientemente versátil para controlar a profundidade de sequenciamento para obter a identidade das espécies biofilme ainda raras. O uso desta tecnologia, tais como bactérias codificado-tag FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP), permitiu perguntas pertinentes sobre a ecologia de biofilmes de ser abordada ^32,33. Tais questões imbuído dificuldades no passado, quando pyrosequencing não estava disponível por causa do tempo e os custos necessários para criar bibliotecas de plasmídeos e as etapas tecnológicas e analíticas complexas necessárias para obter dados ^33,34. É claro que uma grande vantagem com ap independente de culturaabordagens, tais como pyrosequencing, é que as espécies bacterianas que não podem ser cultivadas em isolamento dentro de meios convencionais de laboratório (espécies ou seja viáveis ​​mas não cultiváveis) podem ser cultivadas e identificado no sistema de modelo e a sua abundância relativa na comunidade quantificada ^{35, 36} . Para adicionar perspectiva, já em 1963, o atraso Sigmund Socransky estimou que aproximadamente 50% das bactérias no material isolado a partir do sulco gengival oral humana não poderia ser cultivadas utilizando condies de crescimento laboratoriais ^37.

O objetivo deste artigo é descrever métodos de abordagem para desenvolver biofilmes multi-espécies orais em um sistema microfluídico comercialmente disponível (BioFlux) em: (i) condições representante da cavidade oral humana e (ii) com uma composição e abundância das espécies que é comparável à placa supragengival. Além disso, usando tanto software freeware e comercial, destacamos biofilme como basemedidas de arquitetura pode ser derivada a partir de dados MCVL, com foco em abordagens para quantificar a biomassa do biofilme, aspereza, e viabilidade (com base em coloração Live / Morto). Finalmente, os passos necessários para a colheita de material para análise da diversidade de biofilme por bTEFAP são descritos.

Protocol

O protocolo de coleta de saliva aqui descrito foi revisado pela Universidade de Michigan Institutional Review Board for Subject Pesquisa com Seres Humanos. NOTA: No que diz respeito a avaliações institucionais de trabalho sujeito humano deste tipo, acordos prévios e permissões devem ser obtida a partir da instituição de acolhimento. Em particular, dependendo da instituição, IRB ou aprovação ética pode ter de ser procurado e aprovado antes da coleta de saliva de voluntários humanos pode prosseguir. Com…

Representative Results

Rendering 3D de biofilmes Os resultados representativos são apresentados na Figura 3. Uma ferramenta útil em software IMARIS é a opção de examinar cada fatia da pilha de biofilme recolhido e combiná-los para criar reconstruções tridimensionais. Além disso, os efeitos de sombras artificiais podem ser adicionados para ajudar visualmente interpretar as estruturas tridimensionais. Os biofilmes prestados pode ser orientado em qualquer direção …

Discussion

Este papel métodos destaca as etapas básicas necessárias para configurar e executar um sistema microfluídico de forma a permitir o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies orais derivados da saliva humana reunidas e cultivadas em esterilizada por filtração de 25% reunidas saliva humana. Abordagens para a caracterização do biofilme são dadas, mas deve-se lembrar que essas abordagens descritas são modificáveis ​​e tecnologias adicionais, como, por exemplo, manchas ou rótulos podem ser introduzidas. Por…

Materials

SUPPLIES AND EQUIPMENT	AVAILABLE FROM COMPANY	CATALOG NUMBER
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)	Thermoscientific	Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux microfluidic system	Fluxion	Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Confocal Laser Scanning Microscope	Lecia	SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope	Multiple choices	Multiple choices
Pyrosequencing facilities	Multiple choices	Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80°C	Multiple choices	Multiple choices
Tips (20, 200, and 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)	Multiple choices	Multiple choices
SOFTWARE
Bioflux dedicated software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)