Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic
Summary
The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.
Abstract
Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.
Introduction
A perda de neurónios dopaminérgicos da substância nigra pars compacta conduz aos sintomas motores cardinal de doença de Parkinson (PD), a segunda perturbação neurodegenerativa mais prevalente. A causa básica da morte dessa população neuronal mesencephalic não é conhecido. Para estudar os mecanismos bioquímicos responsáveis pelo desenvolvimento e propriedades moduladoras neurofisiológicos e sobrevivência de neurónios MESDA, várias culturas de células e estudos em modelos animais têm sido utilizados. As linhas celulares imortalizadas, incluindo a linha celular de rato dopaminérgica 1RB 3 AN 27 (N27), o dopaminérgico linha celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, a linha celular híbrida ratinho dopaminérgicos do mesencéfalo e MN9D humano LUHMES células foram utilizadas para estudos bioquímicos e mecanísticos limitados 1 -5. Para o estudo da perda específica de neurónios MESDA, vários neurotoxina baseada em modelos genéticos e foram desenvolvidos 6-8. Culturas do mesencéfalo ventral primárias, Fornecer uma ferramenta indispensável para o estudo das propriedades neuronais e sinápticos dos neurônios dopaminérgicos e os caminhos envolvidos na patogênese desta doença comum.
Aqui apresenta-se um protocolo detalhado para o isolamento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, que contém modificações resultando em maior capacidade de sobrevivência e o aumento de rendimento de lamelas por embrião. O uso de pré-madura mesencéfalo E12.5 rato (E14.5 no rato) aumenta a capacidade de sobrevivência. Nesta idade neurônios não desenvolveram axônios ainda, o que deixa as células intactas durante a dissecção e minimiza o estresse aumentando assim significativamente a viabilidade. Além disso, dissecção cuidadosa do mesencéfalo ventral, conforme descrito no capítulo 2 do presente protocolo, aumenta ainda mais a capacidade de sobrevivência. Para aumentar o número de lamelas por embrião, um método de plaqueamento alternativa é apresentada na seção 4 deste protocolo. Isto conduz a um rendimento de até 10 lamelas por embrião em comparação com 4 lamelas sobcondições de chapeamento padrão reduzindo assim a quantidade de animais por experimentação.
Neurônios em cultura apresentam crescimento dos axônios e dendritos, formam conexões sinápticas e revelar a presença de marcadores neuronais e sinápticos fazendo essas culturas adequado para imagens de células vivas, imunocitoquímica e estudos eletrofisiológicos. Além disso, a utilização de culturas neuronais facilita a manipulação genética e farmacológica. Crescimento de neurites de dia 2 in vitro permite estudos de desenvolvimento. Além disso, a sobrevivência a longo prazo de culturas (até seis semanas) torna-os adequados para o estudo do processo de degeneração lenta e progressiva destes neurónios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neurónios dopaminérgicos no mesencéfalo são a principal fonte de dopamina no sistema nervoso central. Eles são divididos em três grupos, substância negra compacta (SNPC), área tegmental ventral (VTA) eo campo retrorubral (RRF) 10, 11. Os neurônios no SNPC e VTA dar origem a grandes vias dopaminérgicas, mesocorticais, mesolímbica e Nigro-estriato, envolvidos em funções, como controle de emoção, motivação e comportamento motor. A decadência dos neurônios no SNPC e perturbação funcional do s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117) | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048) | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors – Straight 11.5cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
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