Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.
Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch (ssHDX-MS) und Seitenketten photolytische Kennzeichnung (SspI-MS), gefolgt von Massenspektrometrie-Analyse kann nützlich für die Charakterisierung lyophilisierte Formulierungen von Proteintherapeutika. Kennzeichnung, gefolgt von geeigneten proteolytischen Abbau kann der Proteinstruktur und Wechselwirkungen mit dem Peptid-Level-Auflösung abgebildet werden. Da die Proteinstrukturelemente werden durch ein Netzwerk von chemischen Bindungen von den Hauptketten und Seitenketten von Aminosäuren, spezifische Markierung von Atomen in den Aminosäureresten gibt einen Einblick in die Struktur und Konformation des Proteins stabilisiert. Im Gegensatz zu den Routineverfahren verwendet werden, um Proteine in gefriergetrockneten Feststoffe (zB FTIR), ssHDX-MS und SspI-MS quantitative und ortsspezifische Informationen zu studieren. Das Ausmaß der Deuteriumeinbau und kinetischen Parameter können bezogen werden, schnell und langsam den Austausch von Amid-Pools (N schnell, N langsam) und spiegelt unmittelbar die degree der Proteinfaltung und Struktur in lyophilisierte Formulierungen. Stabile photolytische Kennzeichnung nicht zurück Austausch, einen Vorteil gegenüber ssHDX-MS unterzogen werden. Hier stellen wir ausführliche Protokolle sowohl ssHDX-MS und SspI-MS, mit Myoglobin (Mb) als Modellprotein bei lyophilisierten Formulierungen, die entweder die Trehalose oder Sorbit.
Proteinwirkstoffe sind die am schnellsten wachsende Sektor in der biopharmazeutischen Industrie und bieten vielversprechende neue Behandlungsmöglichkeiten für bisher hartnäckigen Krankheiten, darunter hormonelle Störungen, Krebs und Autoimmunerkrankungen ein. Im Jahr 2012 wird der weltweite Markt Biotherapeutika erreicht 138.000.000.000 $ und wird voraussichtlich auf 179 Milliarden Dollar bis zum Jahr 2018 zu erreichen 2. Die Proteine sind größer und zerbrechlicher als herkömmliche Medikamente aus kleinen Molekülen und so sind anfälliger für viele Arten von Abbau 3. Um eine ausreichende Haltbarkeit und Stabilität zu gewährleisten, sind Proteinwirkstoffe oft formuliert als lyophilisierte (dh gefriergetrocknet) feste Pulver. Jedoch kann ein Protein noch abgebaut werden im festen Zustand, insbesondere wenn seine native Struktur wird während des Gefriertrocknungsprozesses 4,5 erhalten. Sicherzustellen, dass Struktur wurde beibehalten machbar ist, nur wenn es analytischen Methoden, die Protein-Konformation in der Festkörper mit sufficien Sonde kannt Auflösung.
NMR 6 und Röntgenkristallographie 7 sind die allgemein üblichen Hochauflösungsverfahren, um die Proteinstruktur in Lösung und kristalline Feststoffe 8 beurteilen. Aufgrund der Art der Hilfsstoffe und Verarbeitungsverfahren sind lyophilisierten Proteinformulierungen üblicherweise eher amorph als kristallin 9. Der Mangel an Homogenität und mikroskopische Ordnung macht die oben erwähnten Techniken unpraktisch für Proteine in amorpher Festkörper. Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) 10, Raman-Spektroskopie 11 und Nahinfrarotspektroskopie (NIR) 12 wurden regelmäßig vom biopharmazeutischen Industrie verwendet, um Sekundärstruktur in lyophilisierter Pulver zu der des nativen Lösungs-Struktur zu vergleichen. Allerdings sind diese Verfahren mit niedriger Auflösung und kann nur Informationen über die globalen Veränderungen in der Sekundärstruktur. Solid-State-strukturelle Charakterisierung mittels FTIRhat entweder schwach 13,14 oder arm 15 Korrelation mit langfristiger Lagerstabilität gezeigt. Diese Einschränkungen machen die Notwendigkeit einer geeigneten hochauflösende Methoden zur Proteinstruktur Störungen in der Festkörper identifizieren.
Chemische Kennzeichnung in Verbindung mit der Proteolyse und massenspektrometrische Analyse wurde als ein leistungsfähiges Konzept für die Überwachung von Proteinstrukturen und molekularen Wechselwirkungen in wässriger Lösung entstanden. In der pharmazeutischen Entwicklung hat HDX-MS für Epitopkartierung in Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen 16,17 verwendet, um Rezeptor-Arzneimittel-Wechselwirkungen 18 zuzuordnen, um die Effekte von posttranslationalen Modifikationen auf die Konformation des Protein-Arzneistoffe 19 zu überwachen und zu vergleichen, Charge-zu-Charge-Änderung in den Entwicklungs Biosimilars 20. Ähnlich photoaktivierbaren Liganden verwendet worden, um Medikamentenziele zu identifizieren und um die Bindungsaffinität und Spezifität der Wirkstoff-Rezeptor-Wechselwirkungen 21,22 bestimmen. Extend die Anwendung dieser Methoden, um lyophilisierte Formulierungen, hat uns entwickelte Festkörper Wasserstoff Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (ssHDX-MS) und Solid-State-photolytischen Kennzeichnung Massenspektrometrie (SSPL-MS) zu Proteinkonformationen und Hilfsstoff-Interaktionen in lyophilisierten Proben studieren mit hoher Auflösung.
In beiden ssHDX-MS und SspI-MS wird das Protein unter idealen Reaktionsbedingungen in lyophilisierter Feststoffe bezeichnet, und die Proben werden dann rekonstituiert und durch Massenspektrometrie mit oder ohne proteolytischen Verdau analysiert. ssHDX-MS informiert über Hauptkette Exposition gegenüber Deuterium Dampf, während SSPL-MS liefert Informationen über die Umgebung der Seitenketten (Abbildung 1). Beide Methoden können somit komplementäre Informationen über Proteinkonformation in der Festkörper bieten. Hier stellen wir eine allgemeine Protokoll für die Untersuchung von Proteinen in lyophilisierter Feststoffe mit ssHDX-MS und SspI-MS (Abbildung 2), wobei Mb alsein Modellprotein. Wir zeigen die Fähigkeit der beiden Verfahren, um Unterschiede in Formulierungen mit zwei unterschiedlichen Hilfsstoffen zu unterscheiden.
Fig. 1: ssHDX und SspI Maßnahme Proteinstruktur in lyophilisierter Feststoffe durch unterschiedliche Markierungsmechanismen (A) In HDX das Rückgrat Amidwasserstoffe Austausch mit Deuterium als Funktion der Proteinstruktur und D 2 O Zugänglichkeit. In der Festkörper, die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Deuterium-Austausch sind abhängig von der Höhe des D 2 O Sorption, Protein Mobilität (Entfaltung und Rückfaltung Ereignisse) und der Art der in der festen Matrix vorhandenen sonstigen Bestandteile. (B) In PL, UV-Bestrahlung bei 365 nm veranlasst die Bildung eines reaktiven Carben-Intermediats aus dem Diazirin funktionelle Gruppe PLeu und unspezifisch in jedes XH-Bindung (X = beliebiges Atom) oder ad eingeüber eine C = C-Bindung in ihrer unmittelbaren Umgebung ded. Bei dem Festzustand die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Markierung hängt von der lokalen Konzentration des Markierungsmittels, Bestrahlungszeit, Proteinstruktur und der Art der in der festen Matrix vorliegende Hilfsstoffe. Die Abbildungen A und B zeigen die maximale theoretische Kennzeichnung, die sich auf Grundgerüst und Seitenketten jeweils in Protein auftreten können.
Abbildung 2: Schematische Darstellung zeigt Festkörper HDX-MS (A) und PL-MS (B) für die Protein in lyophilisierten Formulierung.
Mehrere Studien haben vorgeschlagen, dass die lokale Umgebung in lyophilisierten Proben betrifft Proteinabbau 5,29,30. Jedoch eine direkte Beziehung zwischen Proteinstruktur und Stabilität im festen Zustand war nicht aufgrund des Fehlens von hochauflösenden analytischen Methoden denkbar. Die Anwendung der bestehenden hochauflösende Methoden wie HDX und PL zu lyophilisierte Pulver erfordert eine Modifikation der Lösung Protokolle und sorgfältige Interpretation der Daten. HDX-MS und PL-MS wurden nacheinander angenommen, um Proteinkonformationen in der Festkörper überwachen. Die vorgestellten Ergebnisse hier und anderswo 27,28,31-33 haben die Möglichkeit, diese Methoden zu Proteinkonformation mit hoher Auflösung in der festen Umgebung überwacht demonstriert. Obwohl die wichtigsten Schritte bei der Datenanalyse nicht von der Etikettierung in Lösung 34 bis 36 variieren, sind wichtige Überlegungen bei der Versuchsaufbau und die Interpretation der Daten für die Festkörper chemisch erforderlichcal Kennzeichnung.
Auswahl des Markierungsreagens muss nach Größe und Mechanismus der Markierung beruhen. Die geringe Größe der Deuterium ermöglicht dem Peptid-Rückgrat, leicht untersucht werden, während die relativ größeren Größe PLeu begrenzt Kennzeichnung an den Seitenketten. Sowohl ssHDX und SspI zeigen keine Präferenz für eine beliebige Aminosäure, so dass die Kennzeichnung nur von Grundgerüst und Seitenketten-Exposition auf die Matrix. Um effektiv zu untersuchen Proteinkonformationen in der Festkörper, müssen die externen Faktoren, die die Kennzeichnung Prozess sorgfältig kontrolliert werden. Die Gesamtmenge und die räumliche Verteilung der Markierungsmittel in lyophilisierter Feststoff ist von wässrigen Lösungen.
In ssHDX, kann die Menge an D 2 O in der festen Matrix die Rate der Proteinentfaltung (oder partielle Entfaltung), Rückfaltung und Deuterium-Austausch beeinflussen. Dies ist nicht der Fall mit der Lösung HDX, wobei die Proteinprobe wird normalerweise mit einem großen Volumen von D 2 O verdünntSorgfältige Screening der Wirkungen von Feuchtigkeit auf der ssHDX Rate können die Auswahl der idealen RH Bedingungen. Zur Steuerung der Geschwindigkeit der Feuchtigkeits Sorption und Zusammenbruch der Pulver in Formulierungen, die hygroskopische Hilfsstoffe (zB Saccharose und Trehalose) zu vermeiden, kann ssHDX unter Kühlbedingungen durchgeführt werden (2-8 ° C). Unsere früheren Studie bei Hydratation Wirkungen zeigten eine erhöhte Geschwindigkeit und das Ausmaß des Austausches mit Zunahme der Feuchtigkeitsgehalt, wie erwartet. Im Großteil unserer Arbeit, ein Zwischen RH von 43% bei 5 ° C hat sich als ideal, um Formulierungen in einer vernünftigen Zeit 24 zu unterscheiden. Die Reaktion wird üblicherweise durchgeführt, bis ein Plateau erreicht wird. Dies stellt sicher, dass Feuchtigkeit Sorption und Diffusion in der festen nicht den HDX Rate zu steuern. Die Verwendung von kleinen festen Probengrößen mit vorge Lyophilisierung Volumen ≤2 ml hilft auch zu gewährleisten, dass D 2 O Dampfsorption wesentlichen vollständig ist früh im Wechselperiode. Obwohl ssHDX-MS bietetquantitative Informationen über die Konformation des Proteins in der Festkörper, gibt es bestimmte Bedingungen, bei denen Interpretation der Daten kann nicht vollständig auf dem ssHDX Studie basieren allein. Es ist möglich, dass die verringerte Deuteriumaufnahme in einer Probe (im Vergleich zur Kontrolle) aufgrund der höheren Retention der Proteinstruktur oder die erhebliche Menge an in der Probe vorhandene Proteinaggregaten beobachtet kann. In einem solchen Fall Interpretation der Daten erfordert ssHDX Ergebnisse anderer komplementäre Methoden. Peakverbreiterung in deuteriertem Massenspektren wurde für mehrere Mb Formulierungen 27,28 beobachtet. Dies könnte aufgrund von verschiedenen Faktoren, wie der Anwesenheit von teilweise ungefalteten Proteinpopulation, räumliche Heterogenität in der Probe oder die räumlichen Gradienten in der D 2 O-Konzentration sein. Allerdings wurden diese Faktoren nicht in ssHDX-MS aus und bedarf weiterer Untersuchungen.
Wie SSPL-MS ist relativ neu im Vergleich zu anderen Methoden, kontinuierliches Lernen abihre Anwendungen und Beschränkungen erforderlich. In SspI wird das Photovernetzungsmittel mit dem Protein lyophilisiert. Der Mangel an Feuchtigkeit schränkt die Mobilität der Komponenten innerhalb der festen Matrix, und die Teilstruktur Entspannung, die mit Feuchtigkeitssorption in ssHDX auftreten können, ist kein Phänomen in SSPL. Dies begrenzt die Kennzeichnung in SspI in die unmittelbare Nähe des Photovernetzungsmittels. Jedoch anders als HDX-MS, MS / MS-Analyse der kovalent markierten Proteins rückstands Ebene Strukturinformationen bereitzustellen. Seit SSPL Kennzeichnung kovalente und irreversible, zurück Austausch nicht auf, und Proben vorbereitet und ohne Rücksicht auf Verluste von Etiketten analysiert werden. Zur Verbreitung von Markierungsmittel erleichtern und verbessern Markierungseffizienz in der Festmatrix kann SSPL mit zunehmender% rF durchgeführt werden. PLeu Aufnahme kann auch durch Erhöhung der Konzentration der photoreaktiven Mittels verbessert werden. Das molare Verhältnis von Protein zu PLeu kann wie gewünscht variiert werden. Im allgemeinen wird ein molarer Überschuß von 100x PLeu zu ProProtein wird für eine ausreichende Kennzeichnung. Allerdings können hohe PLeu Konzentration im Verlust der Proteintertiärstruktur in der festen Matrix führen. Daher Neben Kennzeichnung Kinetik und Formulierungszusammensetzung, Auswahl der PLeu Konzentration muss auch auf die Erhaltung Protein strukturelle Integrität basieren. Wie pleu selektiv Etiketten XH (X = C, N, O) -Gruppe, ist es möglich, dass Hilfsstoffe mit ähnlichen Kennzeichnung Websites kann großen Einfluss auf die Höhe der Proteinmarkierung. Die Interferenz der Hilfsstoffe in der Verfügbarkeit von PLeu Proteinmarkierung ist noch zu charakterisieren. Es ist bekannt, dass das aus Diazirin Aktivierung erzeugte Carben ist nicht restspezifischen jedoch eine Studie berichtet Tendenz zu Asp und Glu 36. Während es gut, etwa Rest-spezifische Wechselwirkungen zu lernen ist, ist Peptid-Pegelinformation auch nützlich und können zur Hilfsstoffen zu entwerfen, um Regionen mit hoher Belichtungsmatrix im festen Zustand zu sperren. SSPL-MS bietet detaillierte qualitative Informationen jedochquantitative Daten müssen gewonnen werden und robuste Messdaten entwickelt werden, um Formulierungsunterschiede in einer Vielzahl von gefriergetrockneten Systeme zu analysieren gilt.
Die Verwendung eines rückstandsspezifischen Etikett in Verbindung mit MS / MS-Analyse weiter ausbauen kann Auflösung zu der Aminosäureebene. Markierungsreagenzien, wie 2,3-Butandion beschriften Arg, N-Hydroxysuccinimid-Derivate für Lys und N -alkylmaleimide Derivate für Cys verwendet, um genau abzubilden molekularen Wechselwirkungen in lyophilisiertes Pulver sein. Allerdings sind diese Reagenzien sind pH-abhängig und die Reaktionen nicht als photolytische Kennzeichnung in der Festkörper sowie gesteuert werden. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die Photovernetzungsmittel in der Proteinsequenz mit der Verwendung von auxotrophen Zellinien, ortsgerichtete Mutagenese oder Seitenkette Derivatisierung integrieren.
Unsere früheren ssHDX-MS und SspI-MS-Studien haben gezeigt, dass die Kennzeichnung von Protein hängt von der Art und Menge der Hilfsstoffeverwendet 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS von Mb mit Guanidinhydrochlorid (Gdn.HCl) co-lyophilisiert zeigte eine größere Deuteriumaufnahme als Mb mit niedrigem Molekulargewicht aus zucker 32 co-lyophilisiert. In einem separaten SSPL-MS-Studie, Mb colyophilisierten mit Gdn.HCl zeigten einen größeren Schutz vor photolytische Kennzeichnung als Mb mit Saccharose 33. Ferner quantitative Messungen ssHDX-MS wurden stark von der Stabilität des Proteins während der Langzeitspeicher 28 korreliert. Diese Studien legen nahe, dass ssHDX oder SspI Protein spiegelt das Ausmaß der Strukturretention des Proteins in lyophilisierter Pulver. Wir glauben, dass die Beibehaltung der Sekundärstruktur in lyophilisierte Pulver bietet günstiges Umfeld für die Seitenkette der Markierung mit pleu und den Schutz von Amid Wasserstoff aus Deuterium-Austausch. , Detaillierte Gegenüberstellung der Informationsgehalt von diesen Methoden muss jedoch in der Zukunft durchgeführt werden. Obwohl die Gründung der Nützlichkeit ssHDX-MS-MS und SSPLals Formulierung Screening-Tool wird letztlich verlangen, dass sie zu viele Proteine angewendet werden, ergibt sich aus unserer jüngsten Studien unterstützt ihre weitere Verbreitung. Mit der Weiterentwicklung werden diese Methoden erwarten weithin nützlich für die Charakterisierung von Festkörperproteinformulierungen in der biopharmazeutischen Industrie zu sein.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equine myoglobin | Sigma-Aldrich | M0630-5G | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma Aldrich | #T9531 | |
D-Sorbitol | Sigma Aldrich | #240850 | |
L-Photo-leucine | Thermo Scientific | #22610 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | #P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | #P3786 | |
Deuterium Oxide | Cambridge Isotope Laboratories | #DLM-4-PK | Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich) |
Immobilized pepsin | Applied Biosystems | #2-3132-00 | |
Trypsin | Promega | #V511A | Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used |
Water, Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | #7732-18-5 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | #34998 | |
Formic acid | Thermo Scientific | #28905 | |
ESI-TOF Calibrant | Agilent Technologies | #G1969-85000 | Highly flammable liquid |
Protein microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25108/03 | |
Peptide microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25109/02 | |
Analytical column | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | |
Freeze dryer | VirTis AdVantage Plus | ||
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps | Stratagene Corp. | Stratalinker 2400 | |
HPLC | Agilent Technologies | 1200 series LC | Refrigerated LC system for HDX-MS |
ESI-qTOF MS | Agilent Technologies | 6520 qTOF | |
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) | Sierra Analytics | http://www.massspec.com/HDExaminer.html |