Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.
Amide idrogeno / scambio di deuterio (ssHDX-MS) e della catena laterale fotolitico etichettatura (SSPL-MS), seguita da spettrometria di massa possono essere utili per caratterizzare formulazioni liofilizzate di proteine terapeutiche. Etichettatura seguita da adeguata digestione proteolitica permette la struttura delle proteine e le interazioni da mappare con una risoluzione a livello di peptide. Poiché la proteina elementi strutturali sono stabilizzate da una rete di legami chimici dalle principali catene e catene laterali di aminoacidi, etichettatura specifica degli atomi nei residui amminoacidici permette di comprendere meglio la struttura e la conformazione della proteina. In contrasto con i metodi di routine utilizzati per studiare le proteine in solidi liofilizzati (ad esempio, FTIR), ssHDX-MS e SSPL-MS fornisce informazioni quantitative e specifiche del sito. Il grado di incorporazione di deuterio e parametri cinetici può essere correlato a scambiare rapidamente e lentamente piscine ammide (N veloce, N lento) e riflette direttamente le degree di protein folding e struttura in formulazioni liofilizzati. Etichettatura fotolitico Stabile non subisce back-cambio, un vantaggio rispetto ssHDX-MS. Qui, forniamo protocolli dettagliati sia per ssHDX-MS e SSPL-MS, utilizzando mioglobina (Mb) come modello di proteine in formulazioni liofilizzati contenenti sia trealosio o sorbitolo.
Farmaci proteici sono il settore in più rapida crescita del settore biofarmaceutico e offrono promettenti nuovi trattamenti per le malattie precedentemente incurabili, tra cui disturbi ormonali, tumori e malattie autoimmuni 1. Nel 2012, il mercato globale ha raggiunto biotherapeutics 138.000 milioni dollari e si prevede di raggiungere i 179 miliardi dollari entro il 2018 2. Le proteine sono più grandi e più fragile rispetto ai tradizionali farmaci a piccole molecole e così sono più sensibili a molti tipi di degrado 3. Per assicurare un'adeguata shelf-life e stabilità, farmaci proteici sono spesso formulati come liofilizzato (cioè, liofilizzato) polveri solide. Tuttavia, una proteina può ancora subire degradazione allo stato solido, in particolare se la sua struttura nativa non viene mantenuto durante il processo di liofilizzazione 4,5. Assicurare che la struttura è stata mantenuta è possibile solo se ci sono metodi analitici che possono sondare conformazione proteica nello stato solido con sufficienRisoluzione t.
Spettroscopia NMR 6 e cristallografia a raggi X 7 sono i metodi ad alta risoluzione comunemente usati per valutare la struttura delle proteine in soluzione e cristalline solidi 8. A causa della natura degli eccipienti e metodi di trasformazione utilizzati, formulazioni proteiche liofilizzati sono solitamente amorfi anziché cristallina 9. La mancanza di omogeneità e di ordine microscopico rende le tecniche sopra menzionate impraticabile per le proteine nei solidi amorfi. Spettroscopia in trasformata di Fourier (FTIR) 10, spettroscopia Raman 11 e spettroscopia vicino infrarosso (NIR) 12 hanno regolarmente utilizzati dall'industria biofarmaceutica di confrontare proteina struttura secondaria in polveri liofilizzate a quello della struttura in soluzione-stato nativo. Tuttavia, questi metodi sono a bassa risoluzione e in grado di fornire solo informazioni sui cambiamenti globali nella struttura secondaria. Solid-state caratterizzazione strutturale mediante FTIRha dimostrato sia debole 13,14 o poveri 15 correlazione con la stabilità di archiviazione a lungo termine. Queste limitazioni mettono in evidenza la necessità di metodi ad alta risoluzione adatte per identificare proteine perturbazioni strutturali nello stato solido.
Etichettatura chimica accoppiato con proteolisi e della spettrometria di massa è emerso come un approccio efficace per il controllo struttura delle proteine e le interazioni molecolari in soluzione acquosa. In sviluppo farmaceutico, HDX-MS è stato utilizzato per la mappatura degli epitopi nelle interazioni antigene-anticorpo 16,17, per mappare le interazioni recettore-droga 18, per monitorare gli effetti delle modificazioni post-traslazionali sulla conformazione dei farmaci proteici 19, e per confrontare lotto a lotto variazione sviluppare biosimilari 20. Analogamente, ligandi fotoattivabile sono stati utilizzati per identificare bersagli farmacologici e determinare l'affinità di legame e la specificità delle interazioni farmaco-recettore 21,22. Per inviarextend l'applicazione di questi metodi a formulazioni liofilizzati, il nostro gruppo ha sviluppato a stato solido spettrometria di massa di scambio idrogeno deuterio (ssHDX-MS) e allo stato solido spettrometria di massa etichettatura fotolitico (SSPL-MS) per studiare conformazioni di proteine e le interazioni eccipiente in campioni liofilizzati con alta risoluzione.
In entrambi ssHDX-MS e SSPL-MS, la proteina è etichettato in condizioni di reazione ideali in solidi liofilizzati, ei campioni sono poi ricostituito e analizzato mediante spettrometria di massa con o senza digestione proteolitica. ssHDX-MS fornisce informazioni sulla catena principale di esposizione al vapore di deuterio, mentre SSPL-MS fornisce informazioni sull'ambiente delle catene laterali (Figura 1). I due metodi possono perciò fornire informazioni complementari su conformazione proteica in stato solido. Qui, forniamo un protocollo generale per lo studio delle proteine nei solidi liofilizzati utilizzando ssHDX-MS e SSPL-MS (figura 2), utilizzando come Mbun modello della proteina. Noi mostriamo la capacità dei due metodi per distinguere differenze di formulazioni con due diversi eccipienti.
Figura 1:. SsHDX e SSPL struttura proteica misura in solidi liofilizzati attraverso diversi meccanismi di etichettatura (A) In HDX, l'ammide backbone idrogeni scambio con deuterio in funzione della struttura delle proteine e D 2 O accessibilità. Nello stato solido, la velocità ed il grado di conversione di deuterio dipendono dal livello di D 2 O assorbimento, la mobilità della proteina (e sulla ripiegatura eventi) e la natura degli eccipienti presenti nella matrice solida. (B) In PL, irraggiamento UV a 365 nm inizia la formazione di un intermedio reattivo carbene dal gruppo funzionale diazirine di pLeu ed è inserito in modo non specifico in nessuna legame XH (X = qualsiasi atomo), o added attraverso un legame C = C nelle sue immediate vicinanze. Nello stato solido, la velocità e l'entità etichettatura dipendono dalla concentrazione locale dell'agente etichettatura, tempo di irradiazione, struttura proteica e la natura degli eccipienti presenti nella matrice solida. Pannelli A e B mostrano l'etichettatura teorica massima che può verificarsi su backbone e catene laterali rispettivamente di proteine.
Figura 2: Schema a stato solido che mostra HDX-MS (A) e PL-MS (B) per la proteina nella formulazione liofilizzata.
Diversi studi hanno suggerito che l'ambiente locale in campioni liofilizzati colpisce proteine degrado 5,29,30. Tuttavia, stabilendo una relazione diretta tra struttura proteica e stabilità allo stato solido non è possibile a causa della mancanza di metodi analitici ad alta risoluzione. L'applicazione di metodi di risoluzione elevate esistenti come HDX e PL di polveri liofilizzate richiede la modifica dei protocolli di soluzioni e un'attenta interpretazione dei dati. HDX-MS e PL-MS sono stati successivamente adottati per monitorare conformazioni di proteine nello stato solido. I risultati qui presentati e altrove 27,28,31-33 hanno dimostrato la capacità di questi metodi per monitorare conformazione proteica con alta risoluzione in ambiente solido. Anche se i passaggi critici in analisi dei dati non si discostano da etichettatura in soluzione 34-36, importanti considerazioni durante l'installazione sperimentale e l'interpretazione dei dati sono necessari per chemi a stato solidoetichettatura cal.
Selezione del reagente etichettatura deve essere basata sulla dimensione e il meccanismo di etichettatura. Le piccole dimensioni del deuterio permette al backbone peptidico per tastare facilmente, considerando le dimensioni relativamente maggiore di pLeu limita etichettatura alle catene laterali. Sia ssHDX e SSPL mostrano alcuna preferenza per qualsiasi amminoacido, in modo che l'etichettatura dipende solo backbone e catena laterale esposizione alla matrice. Per sondare efficacemente conformazioni di proteine a stato solido, i fattori esterni che influenzano il processo di etichettatura devono essere controllati attentamente. L'importo totale e la distribuzione spaziale di agente etichettatura in solidi liofilizzati è diverso da soluzioni acquose.
In ssHDX, la quantità di D 2 O nella matrice solida può influenzare la velocità di svolgimento proteine (o parziale dispiegamento), ripiegando e cambio deuterio. Questo non è il caso con la soluzione HDX, in cui il campione di proteine è normalmente diluito con un ampio volume di D 2 O.Proiezione accurata degli effetti di idratazione sul tasso ssHDX può informare la selezione di condizioni ideali RH. Per controllare la velocità di assorbimento di umidità ed evitare il collasso della polvere in formulazioni contenenti eccipienti igroscopici (ad esempio saccarosio e trealosio), ssHDX può essere effettuata in condizioni refrigerate (2-8 ° C). Il nostro studio precedente sugli effetti di idratazione ha mostrato un aumento dei tassi e l'entità di scambio con aumento del contenuto di umidità, come previsto. In gran parte del nostro lavoro, un RH intermedio del 43% a 5 ° C si è dimostrata ideale distinguere formulazioni in un tempo ragionevole 24. La reazione viene solitamente effettuata fino a raggiungere un plateau. Questo assicura che assorbimento di umidità e la diffusione nel solido non controllano il tasso HDX. L'uso di piccole dimensioni dei campioni solidi con volume di pre-liofilizzazione di ≤2 ml aiuta anche a garantire che D 2 O vapore assorbimento è sostanzialmente completo all'inizio del periodo di scambio. Anche se ssHDX-MS fornisceinformazioni quantitative sulla conformazione della proteina in stato solido, ci sono alcune condizioni in cui l'interpretazione dei dati non può essere interamente basato sullo studio ssHDX solo. È possibile che l'assorbimento di deuterio diminuzione osservata in un campione (in confronto al controllo) può essere dovuta alla maggiore ritenzione della struttura proteica o la notevole quantità di aggregati proteici presenti nel campione. In tal caso, l'interpretazione dei dati ssHDX richiede risultati ottenuti con altri metodi complementari. Ampliamento Peak in spettri di massa deuterato è stato osservato per diverse formulazioni Mb 27,28. Questo potrebbe essere dovuto a vari fattori come la presenza della popolazione proteine parzialmente unfolded, eterogeneità spaziale nel campione oppure i gradienti spaziali nella concentrazione D 2 O. Tuttavia, questi fattori non sono stati distinti in ssHDX-MS e necessita di ulteriori indagini.
Come SSPL-MS è relativamente nuovo rispetto ad altri metodi, ab apprendimento continuole sue applicazioni e le limitazioni è necessario. In SSPL, foto-cross-linker viene liofilizzata con la proteina. La mancanza di umidità limita la mobilità dei componenti all'interno della matrice solida, e il rilassamento strutturale parziale che può verificarsi con assorbimento di umidità in ssHDX non è un fenomeno in SSPL. Questo limita etichettatura SSPL alle immediate vicinanze della foto-cross-linker. Tuttavia, a differenza HDX-MS, analisi MS / MS della proteina covalentemente etichettato può fornire livello residuo informazioni strutturali. Dal momento che l'etichettatura SSPL è covalente e irreversibile, di nuovo cambio non si verifica e campioni può essere preparato e analizzato senza preoccupazione per la perdita di etichetta. Per facilitare la diffusione dell'agente etichettatura e migliorare l'efficienza di etichettatura in solido-matrice, SSPL può essere eseguita con l'aumentare% RH. pLeu assorbimento può essere migliorata aumentando la concentrazione dell'agente fotoreattivo. Il rapporto molare di proteine per pLeu può essere variato come desiderato. In generale, un eccesso 100x molare di pLeu a proTEIN garantirà un'adeguata etichettatura. Tuttavia, alta concentrazione pLeu può causare la perdita di proteine struttura terziaria nella matrice solida. Quindi, Oltre a cinetiche di etichettatura e composizione formulazione, selezione di concentrazione pLeu deve basarsi sul mantenimento proteine integrità strutturale. Come pLeu etichette non selettivamente XH (dove X = C, N, O) gruppo, è possibile che gli eccipienti con siti di etichettatura simili possono influenzare notevolmente il livello di etichettatura proteine. L'interferenza degli eccipienti nella disponibilità di pLeu per l'etichettatura proteina è ancora da caratterizzare. È noto che la carbene generato dall'attivazione diazirine non è specifica residui tuttavia uno studio riporta propensione Asp e Glu 36. Mentre è bene conoscere interazioni specifiche residui, informazioni peptide-livello è anche utile e può essere utilizzato per progettare eccipienti di bloccare regioni con elevata esposizione matrice allo stato solido. SSPL-MS fornisce informazioni qualitative dettagliate, tuttaviaha bisogno di dati quantitativi che si vuole ottenere e metriche robuste devono essere sviluppate per analizzare le differenze di formulazione attraverso una varietà di sistemi di liofilizzati.
L'uso di un'etichetta specifico residuo combinato con analisi MS / MS può migliorare ulteriormente risoluzione al livello amminoacido. Reagenti Etichettatura quali 2,3-butanedione di etichettare Arg, N derivati -hydroxysuccinimide per Lys e N derivati -alkylmaleimide per Cys può essere utilizzato per mappare con precisione le interazioni molecolari in polvere liofilizzata. Tuttavia questi reagenti sono pH-dipendenti e le reazioni non possono essere così controllati, come l'etichettatura fotolitico in stato solido. Un approccio alternativo è di incorporare la foto-cross-linker nella sequenza proteica con l'uso di linee cellulari auxotrofi, mutagenesi sito-diretta o catena laterale derivatizzazione.
I nostri precedenti studi ssHDX-MS e SSPL-MS hanno dimostrato che l'etichettatura delle proteine dipende dalla natura e la quantità degli eccipientiutilizzato 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS di Mb co-liofilizzato con guanidina cloridrato (Gdn.HCl) hanno mostrato maggiore assorbimento di deuterio di Mb co-liofilizzato a basso peso molecolare zuccheri 32. In uno studio SSPL-MS separato, Mb co-liofilizzato con Gdn.HCl ha mostrato una maggiore protezione da etichettatura fotolitico di Mb con saccarosio 33. Inoltre, le misure quantitative da ssHDX-MS sono stati fortemente correlati con la stabilità di proteine durante la conservazione a lungo termine 28. Questi studi suggeriscono che ssHDX o SSPL di proteine riflette il grado di ritenzione strutturale della proteina in polvere liofilizzata. Noi crediamo che il mantenimento della struttura secondaria in polveri liofilizzate fornisce un ambiente favorevole per l'etichettatura catena laterale con pLeu e la protezione di ammide idrogeno da cambio deuterio. Tuttavia, confronto dettagliato del contenuto informativo di questi metodi deve essere eseguita in futuro. Sebbene stabilire l'utilità di ssHDX-MS e SSPL-MScome strumento di screening formulazione alla fine richiederà che essere applicato a molte proteine, i risultati dei nostri studi recenti supportano l'adozione più ampia. Con un ulteriore sviluppo, questi metodi dovrebbero essere ampiamente utile per caratterizzare formulazioni di proteine a stato solido nel settore biofarmaceutico.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equine myoglobin | Sigma-Aldrich | M0630-5G | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma Aldrich | #T9531 | |
D-Sorbitol | Sigma Aldrich | #240850 | |
L-Photo-leucine | Thermo Scientific | #22610 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | #P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | #P3786 | |
Deuterium Oxide | Cambridge Isotope Laboratories | #DLM-4-PK | Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich) |
Immobilized pepsin | Applied Biosystems | #2-3132-00 | |
Trypsin | Promega | #V511A | Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used |
Water, Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | #7732-18-5 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | #34998 | |
Formic acid | Thermo Scientific | #28905 | |
ESI-TOF Calibrant | Agilent Technologies | #G1969-85000 | Highly flammable liquid |
Protein microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25108/03 | |
Peptide microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25109/02 | |
Analytical column | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | |
Freeze dryer | VirTis AdVantage Plus | ||
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps | Stratagene Corp. | Stratalinker 2400 | |
HPLC | Agilent Technologies | 1200 series LC | Refrigerated LC system for HDX-MS |
ESI-qTOF MS | Agilent Technologies | 6520 qTOF | |
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) | Sierra Analytics | http://www.massspec.com/HDExaminer.html |