Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
Het vermogen om menselijke somatische cellen herprogrammeren in embryonale stamcel-achtige geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) werd ontdekt door Takahashi et al. In 2007 1. Menselijke huidfibroblasten getransduceerd met retrovirussen expressie vier transcriptiefactoren (de zoge- noemde Yamanaka factoren Oct3 / 4, Sox2, c-Myc en Klf4) bleken vrijwel gelijkwaardig aan menselijke embryonale stamcellen (hESCs) op basis van morfologie, proliferatie, genexpressie en epigenetische status te hebben; cruciaal, iPSCs ook kunnen differentiëren in cellen van alle drie kiembladen 1. De proliferatieve potentie en differentiatie aantal iPSCs maakt hen zeer aantrekkelijk gereedschap; door herprogrammering cellen van patiënten die lijden aan specifieke ziekten, kan iPSCs worden gebruikt als in vitro ziekte modelsystemen en als potentiële therapeutica.
Voor het laatste doel, moet een aantal zaken voordat het volledige potentieel van iPSCs worden aangepaktin een klinische omgeving kan worden gerealiseerd; het tumorigene potentieel van in vitro gekweekte hESCs en iPSCs, het gebruik van xenogene derivaten tijdens herprogrammering en celonderhoud en de noodzaak getransplanteerde cellen te volgen in vivo zijn cruciaal obstakels voor de klinische toepassing van pluripotente stamcellen (Beoordeeld door Hentze et bij. 2). Een ideale oplossing om de noodzaak voor het bijhouden van gedifferentieerde cellen na transplantatie zou een visueel detecteerbare merker die weerstaat zwijgen en schakering ongeacht de toepassing betrekken. Robuuste en duurzame expressie van geïntegreerde transgenen is eerst haalbaar wanneer exogeen DNA wordt ingebracht in safe-harbour loci; dat wil zeggen, genomisch sites die voldoende transcriptie van een geïntegreerde vector mogelijk terwijl tegelijkertijd verzachtende verstoringen van expressie in naburige genen 3. Een zo'n site die is goed gekarakteriseerd sinds zijn ontdekking is het adeno-geassocieerde virus integratie site 1 (AAVS1), in het eerste intron van het proteïne fosfatase 1 regulerende subeenheid 12C (PPP1R12C) gen. Dit gen is aangetoond niet alleen toestaan duurzame en robuuste expressie van transgenen geïntegreerd via uitgebreide tijd in kweek en in vitro differentiatie 3, maar tevens tot omliggende genen van transcriptionele verstoring 4; beide functies zijn waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van endogene chromatine isolatorelementen flankeren de AAVS1 plaats 5.
Vooruitgang in genoom engineering tools in slechts de afgelopen tien jaar aanzienlijk vergemakkelijkt het gemak en de efficiëntie waarmee genetische manipulaties in elk celtype worden bereikt. Terwijl vroege succesvolle experimenten gebruikt buitengewoon lage endogene homologe recombinatie (HR) met een geïntroduceerd donor gen bereiken targeting in SER 6,7, het gebruik van plaats-specifieke nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs), dat significantly induceren van homologe recombinatie door het genereren van een dubbelstrengs DNA-break is sterk toegenomen de efficiëntie van dergelijke experimenten 8,9. De herbestemming van zowel transcriptie activator-achtige effectoren (verhalen) van plantaardige pathogene Xanthomonas geslachten en de prokaryote geclusterd regelmatig afgewisseld korte palindroom herhalingen (CRISPR) / Cas9 systeem in efficiënte site-specific ontwerper nucleases heeft gentargeting gemaakt in pluripotente stamcellen een toegankelijke en uitvoerbaar methodologie 10-13.
Een recent artikel beschreef een efficiënte methode voor de stabiele integratie van een groen fluorescerend reporter cassette in de AAVS1 safe-haven locus in menselijke iPSCs behulp VERHAAL nucleases (Talens) 14. Deze gerichte iPSCs behielden hun fluorescentie zelfs nadat gericht differentiatie naar hartspiercellen en transplantatie in een muismodel van myocardinfarct (MI), het verstrekken van sterk bewijs voor het nut van dergelijkestabiel fluorescerende pluripotente stamcellen 14. Gerichte kolonies te krijgen, werd een gen-trap methode waarbij een splicing-acceptor (SA), 2A zelf-splitsende peptide sequentie plaatst het puromycine N-acetyl-transferase (PAC) gen onder controle van de endogene PPP1R12C promoter; dus, alleen iPSCs dat het DNA schenker ten AAVS1 locus hebben opgenomen uiten PAC, waardoor ze selecteerbaar gebaseerd op puromycine- weerstand; (Figuur 1, 15). Dit protocol beschrijft de procedures voor het genereren van AAVS1-GFP iPSCs gemeld in het recente document 14, met inbegrip van het proces van het transfecteren iPSCs met Talens en een 9,8 kb donor naar een 4.2kb DNA-fragment in de AAVS1 safe-harbour locus integreren, selecteren iPSCs gebaseerd op puromycine-resistentie en plukken kolonies klonale expansie. De hierin beschreven technieken kunnen worden toegepast op vele genoom technische experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen voor de succesvolle generatie AAVS1 safe-haven gerichte menselijke iPSCs zijn: (1) efficiënt leveren van TALEN en donorplasmiden in iPSCs door transfectie; (2) het optimaliseren van dissociatie van iPSCs in enkele cellen voor transfectie en uitplaatdichtheid na transfectie; (3) optimalisatie van de dosis en de geneesmiddel-selectie op basis van de groei van iPSC lijn; (4) voorzichtig ontleden en het plukken van gerichte koloniën en de overdracht aan de nieuwe plaat / goed. In vergelijking me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
