Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Summary

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Abstract

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Introduction

embriyonik kök hücre benzeri uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine (iPSCs), insan somatik hücreleri yeniden programlamak için yeteneği ilk olarak Takahashi ve arkadaşları tarafından keşfedildi. 2007'de ^1. retrovirüsler dört transkripsiyon faktörlerini ifade ile transdük İnsan dermal fibroblastlar (so-dublaj Yamanaka Oct3 faktörleri / 4, Sox2, c-Myc ve Klf4) morfoloji, çoğalması, gen ekspresyonu ve epigenetik durumuna göre, insan embriyonik kök hücreler (HESC) büyük ölçüde benzer olduğu gösterilmiştir; önemlisi, iPSCs da, tüm üç germ ¹ hücrelerine ayrım yapabilmektedir. iPSCs çoğalma potansiyeli ve farklılaşma kapasitesi onlara çok cazip araçlar yapar; Belirli hastalıklara yakalanmış hastalardan alınan hücrelerin yeniden programlanması, iPSCs, in vitro bir hastalık modeli olarak ve potansiyel terapötik maddeler olarak hem de kullanılabilir.

İkinci amaçla, çeşitli konularda iPSCs tam potansiyeline önce ele alınmalıdırKlinik bir ortamda gerçekleştirilebilir; In vitro kültürlenmiş HESC ve iPSCs, yeniden programlama ve hücre bakım sırasında ksenojenik türevlerinin kullanımına tümörojenik potansiyeli ve in vivo olarak nakledilen hücrelerin izlemek için olan ihtiyaç en Hentze et tarafından yapılmıştır pluripotent kök hücrelerin klinik uygulama (tüm önemli engeller vardır. ^2). Farklılaşmış hücreler transplantasyon sonrası izleme ihtiyacı için ideal bir çözüm ne olursa olsun uygulama susturulması ve renklilik direnen bir görsel tespit işaretleyici içerecektir. Eksojen DNA güvenli liman loci içine sokulduğunda entegre transgenlerin sağlam ve kalıcı sentezleme en kolayca elde edilebilir; yani, bir entegre vektör yeterli transkripsiyonunu sağlayacak genomik siteleri komşu genlerin ³ ifade düzensizlikler hafifletici aynı zamanda da. Çok iyi keşfedildiğinden beri karakterize edilmiştir Böyle bir site adeno-ilişkili virüs, Integr olanprotein fosfataz 1 düzenleyici alt birimi 12C (PPP1R12C) geninin ilk intronu içinde tirme Alanı 1 (AAVS1). Bu odağı sürekli ve genişletilmiş zaman içinde entegre transgenlerin sağlam ifade kültürü ve in vitro farklılaşma ^3, aynı zamanda transkripsiyonel pertürbasyon ⁴ genlerin çevreleyen korumak için izin veren değil, sadece gösterilmiştir; Her iki özellik nedeniyle AAVS1 sitesini ⁵ yan endojen kromatin izolatör elemanlarının varlığı olduğu düşünülmektedir.

Sadece son on yılda genom mühendislik araçları gelişmeler büyük ölçüde herhangi bir hücre tipinde genetik manipülasyonlar elde edilebildiği kolaylığı ve verimliliği kolaylaştırmıştır. Erken başarılı deneyler EKH ^6,7 hedefleme geni elde etmek için bir tanıttı donörü ile endojen homolog rekombinasyon (HR) olarak son derece düşük seviyelerde dayanıyordu ederken, çinko parmak nükleazlardır (ZFNs), signi ki gibi site-spesifik nükleazlara, kullanımıficantly, bu gibi deneylerin ^8,9 verimliliğini arttırdı büyük bir çift-iplikçikli DNA kırılmasının nesil ile homolog rekombinasyonu teşvik eder. Her iki transkripsiyon aktivatörü gibi etkileyicilerin bitki patojeni xanthomanas cinslerin (Tales) ve prokaryotik kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) verimli site-spesifik tasarımcı nükleazlara içine / Cas9 sistemi yeniden amaç pluripotent kök hücreleri hedef geni yaptı erişilebilir ve Uygulanabilir metodoloji ^10-13.

Yeni bir kağıt TACE'nin nükleazlar (TALENS) ¹⁴ kullanılarak insan iPSCs olarak AAVS1 güvenli liman lokusuna yeşil flüoresan raportör kaseti kararlı entegrasyonu için etkili bir yöntem açıklamıştır. Bunlar hedeflenen iPSCs böyle bir programı için güçlü kanıtlar sunan, hatta miyokard infarktüsü (MI) bir fare modeli kardiyomiyositlerinin ve transplantasyon yönelik farklılaşma sonra floresan devamstabil floresan pluripotent kök hücreler ^14. Hedeflenen koloniler elde etmek için, bir gen trap yöntemi bir ekleme-alıcı (SA), 2A kendi kapanan peptid dizisi, endojen PPP1R12C promoterinin kontrolü altında puromisin, N-asetil-transferaz (PAC) geni yerleştirir, burada kullanıldı; Böylece, AAVS1 lokustaki DNA donör dahil yalnızca iPSCs puromycin direnci dayalı seçilebilir onları render, PAC ifade; (Şekil 1, ^15). Bu protokole göre iPSCs, AAVS1 GFP iPSCs TALENS ile iPSCs transfekte süreci ve AAVS1 güvenli liman lokusunun bir 4.2kb DNA fragmanı entegre etmek için bir 9.8 kb verici de dahil olmak üzere, son kağıt ¹⁴ bildirilmiştir üreten seçilmesi işlemlerini detayları puromisin-dirençli ve klonal genişleme için çekme kolonileri. Burada tarif edilen teknikler bir çok genom mühendisliği deneylere uygulanabilir.

Protocol

1. Bodrum Membran Matrix hazırlanması ve Plasticware Kaplama Buz üzerine -20 ° dondurulmuş bazal membran matris stok yerleştirin ve 4 ° C'de bir gece eritin. Çözündükten sonra, önceden soğutulmuş Eppendorf tüpleri içine taban membran matrisi pipet 2 mg'lik parçalara. Gerekli olana kadar -20 ° C'de bu saklayın. , Bazal membran matris kaplı plakaları hazırlamak Eppendorf tüp kaybolana buz son parçası (genellikle 2 ~ içinde saat) kadar buz üzerinde bir k…

Representative Results

Protokolün bir görselleştirme iPSCs NutriStem için ya E8, yeşil veya mavi tarafından vurgulanan farklı bir ortam içinde kültürlenir dönemlerin, Şekil 2'de verilmiştir. Sadece yüksek kaliteli iPSCs transfekte etmek önemlidir; Rutin bakım boyunca kültür yemekleri incelemek ve iPSC kültürleri bir Arnavut kaldırımı gibi morfoloji taşıyan başta farklı koloniler (Şekil 3A) içerdiğini doğrulayın; farklılaşmış hücre kültürünün% 10'dan fazla işga…

Discussion

(1) verimli transfeksiyonla iPSCs içine TALEN ve donör plazmitlerini teslim;: AAVS1 güvenli liman başarılı nesil için en kritik adımlar insan iPSCs vardır hedefli (2) transfeksiyondan sonra transfeksiyon ve kaplama yoğunluğu önce tek hücre içine iPSCs ayrılmasını optimize; (3) doz ve iPSC hattının büyüme dayalı ilaç seçimi süresi optimize; (4) dikkatli diseksiyon ve hedeflenen koloniler toplama ve / kuyu yeni plaka transfer. Hockemeyer en kağıt ¹⁰ kullanılan benzer yöntemlerle kar…

Materials

NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT	COMPANY	CATALOG #	COMMENTS/DESCRIPTION
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL	Corning	354230	Store at -20°C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4°C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR – Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4°C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061