अभिकर्मक, चयन, और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की कालोनी उठा AAVS1 सुरक्षित हार्बर में एक GFP जीन के साथ talen-लक्षित
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
भ्रूण स्टेम सेल की तरह प्रेरित स्टेम कोशिकाओं में (IPSCs) मानव दैहिक कोशिकाओं reprogram करने की क्षमता पहले ताकाहाशी एट अल द्वारा की खोज की थी। 2007 में 1। रेट्रोवायरस चार प्रतिलेखन कारक व्यक्त के साथ transduced मानव त्वचीय fibroblasts (इतनी-करार दिया यामानाका Oct3 कारकों / 4, Sox2, सी Myc, और Klf4) आकृति विज्ञान, परमाणु प्रसार, जीन अभिव्यक्ति, और epigenetic स्थिति पर आधारित मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) को अत्यधिक समान होना दिखाया गया; महत्वपूर्ण, IPSCs भी तीनों जनन परतें एक की कोशिकाओं में फर्क करने में सक्षम हैं। IPSCs की proliferative संभावित और भेदभाव क्षमता उन्हें बहुत आकर्षक औजार बनाता है; विशिष्ट रोगों से पीड़ित रोगियों से कोशिकाओं reprogramming द्वारा, IPSCs इन विट्रो रोग मॉडल प्रणाली के रूप में और संभावित चिकित्सा विज्ञान के रूप में दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है।
बाद के प्रयोजन के लिए, कई मुद्दों IPSCs की पूरी क्षमता से पहले संबोधित किया जाना चाहिएएक नैदानिक सेटिंग में महसूस किया जा सकता है; इन विट्रो सुसंस्कृत hESCs और IPSCs, reprogramming और सेल रखरखाव के दौरान xenogenic डेरिवेटिव के उपयोग की tumorigenic क्षमता है, और इन विवो में प्रतिरोपित कोशिकाओं ट्रैक करने की आवश्यकता पर Hentze एट द्वारा समीक्षित स्टेम सेल के नैदानिक आवेदन (करने के लिए सभी महत्वपूर्ण बाधा दौड़ रहे हैं। 2)। विभेदित कोशिकाओं बाद प्रत्यारोपण पर नज़र रखने के लिए जरूरत के लिए एक आदर्श समाधान की परवाह किए बिना आवेदन के मुंह बंद करने और विचित्र रंगना को तैयार नहीं है कि एक नेत्रहीन पता लगाने योग्य मार्कर शामिल होगा। बहिर्जात डीएनए सुरक्षित बंदरगाह स्थल में पेश किया जाता है जब एकीकृत transgenes की मजबूत और निरंतर अभिव्यक्ति सबसे आसानी से प्राप्त है; वह यह है कि एक एकीकृत वेक्टर के पर्याप्त प्रतिलेखन सक्षम है कि जीनोमिक साइटों पड़ोसी जीन 3 में अभिव्यक्ति की perturbations को कम ही समय में जबकि। बहुत अच्छी तरह से अपनी खोज के बाद से बताया गया है कि एक ऐसी साइट एडिनो से जुड़े वायरस integr हैप्रोटीन फॉस्फेट एक विनियामक सबयूनिट 12C (PPP1R12C) जीन की पहली Intron में समझना साइट 1 (AAVS1),। यह ठिकाना निरंतर और विस्तारित समय के माध्यम से एकीकृत transgenes की मजबूत अभिव्यक्ति संस्कृति में और इन विट्रो भेदभाव 3 में, लेकिन यह भी ट्रांसक्रिप्शनल गड़बड़ी 4 से जीन के आस-पास की रक्षा के लिए अनुमति देने के लिए न केवल दिखाया गया है; दोनों सुविधाओं की वजह से AAVS1 साइट 5 flanking अंतर्जात क्रोमेटिन इन्सुलेटर तत्वों की उपस्थिति के लिए माना जाता है।
सिर्फ पिछले एक दशक में जीनोम इंजीनियरिंग उपकरण के क्षेत्र में अग्रिम बहुत किसी भी प्रकार की कोशिका में आनुवंशिक जोड़तोड़ प्राप्त किया जा सकता है जिसके साथ आसानी और दक्षता में मदद की है। जल्दी सफल प्रयोगों ESCs 6,7 में लक्षित जीन को प्राप्त करने के लिए एक शुरुआत की दाता के साथ अंतर्जात मुताबिक़ पुनर्संयोजन (एचआर) के बेहद निम्न स्तर पर भरोसा करते हैं, जैसे जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), signi रूप में है कि साइट विशेष न्युक्लिअसिज़, का उपयोगficantly ऐसे प्रयोगों 8,9 की दक्षता में वृद्धि हुई एक डबल असहाय डीएनए को तोड़ने की पीढ़ी के माध्यम से मुताबिक़ पुनर्संयोजन प्रेरित। दोनों प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रभावोत्पादक संयंत्र रोगजनक xanthomonas पीढ़ी की (कहानियाँ) और प्रोकार्योटिक क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) कुशल साइट विशेष डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ में / Cas9 प्रणाली की repurposing स्टेम सेल में लक्षित जीन बना दिया है एक सुलभ और साध्य कार्यप्रणाली 10-13।
हाल ही में एक कागज कहानी न्युक्लिअसिज़ (TALENS) 14 का उपयोग करते हुए मानव IPSCs में AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह ठिकाना में एक हरे रंग फ्लोरोसेंट संवाददाता कैसेट के स्थिर एकीकरण के लिए एक कारगर तरीका वर्णित है। इन लक्षित IPSCs ऐसी की उपयोगिता के लिए पुख्ता सबूत उपलब्ध कराने के भी रोधगलन (एमआई) के एक माउस मॉडल में cardiomyocytes और प्रत्यारोपण के लिए निर्देशित भेदभाव के बाद उनके प्रतिदीप्ति बनाए रखाstably फ्लोरोसेंट स्टेम सेल 14। लक्षित कालोनियों को प्राप्त करने के लिए, एक जीन-जाल विधि एक splicing के स्वीकर्ता (एसए), 2A आत्म cleaving पेप्टाइड अनुक्रम अंतर्जात PPP1R12C प्रमोटर के नियंत्रण के तहत puromycin एन एसिटाइल-ट्रांस्फ़्रेज़ (पीएसी) जीन रखता है जिसमें इस्तेमाल किया गया था; इस प्रकार, AAVS1 ठिकाना पर डीएनए दाता को शामिल किया है कि केवल IPSCs puromycin प्रतिरोध के आधार पर चयन उन्हें प्रतिपादन, पीएसी व्यक्त; (चित्रा 1, 15)। इस प्रोटोकॉल के आधार पर IPSCs, AAVS1-GFP के IPSCs TALENS साथ IPSCs transfecting की प्रक्रिया और AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह ठिकाना में एक 4.2kb डीएनए टुकड़ा एकीकृत करने के लिए एक 9.8 केबी दाता सहित हाल के पेपर 14 में रिपोर्ट पैदा करने के चयन की प्रक्रिया का विवरण puromycin प्रतिरोध, और क्लोनल विस्तार के लिए उठा कालोनियों। इस के साथ साथ वर्णित तकनीकों कई जीनोम इंजीनियरिंग प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
(1) कुशलतापूर्वक अभिकर्मक से IPSCs में talen और दाता प्लास्मिड पहुंचाने;: AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह के सफल पीढ़ी के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम मानव IPSCs कर रहे हैं लक्षित (2) अभिकर्मक के बाद अभिकर्मक और चढ़ाना घनत्व पहले एक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
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