Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per iniettare mezzi di contrasto ecografici microbolle in vita, isolata tardo-gestazione di embrioni murini stage. Questo metodo consente lo studio dei parametri di perfusione e di marcatori molecolari vascolari all'interno dell'embrione con mdc alta frequenza ecografica.
Abstract
Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or αvβ3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.
Introduction
Mdc ecografia fa uso di mezzi di contrasto microbolle di visualizzare e caratterizzare l'ambiente vascolare. Questi agenti consentono la valutazione non invasiva del microcircolo, vascolarizzazione e la funzione cardiovascolare. Inoltre, la modifica della superficie bolla può provocare microbolle mirate legame biomarker endoteliali, come dimostrato in applicazioni preclinici di angiogenesi, aterosclerosi e infiammazione 1,2 rendendo molecolare ecografico di eventi vascolari possibili. Ultrasuoni può quindi essere utilizzato per identificare gli ambienti complessi e diversi che influenzano gli stati vascolari sani e malati 3-5.
Nel numero ultimi anni, l'interesse per l'utilità dell'imaging microbolle ha esteso il modello di topo embrione versatile. Come un modello di sviluppo dei mammiferi, l'introduzione di microbolle nel sistema vascolare embrionale migliora fisiologicostudio del sistema circolatorio in via di sviluppo (ad esempio, il flusso di sangue, la gittata cardiaca) e in caso di transgenici e mirati modelli mutanti murini di malattie cardiache 6,7, può produrre intuizioni come i fattori genetici alterare la funzione cardiovascolare. In realtà, 2D quantitativa e qualitativa di analisi vascolare cerebrale embrionale sono già stati raggiunti 8. Inoltre, l'embrione del mouse presenta come un ottimo modello per esaminare il legame di microbolle mirati ai marcatori vascolari in vivo. Bartelle et al. 9, per esempio, hanno introdotto microbolle avidina in embrione ventricoli cardiaci per valutare bersaglio 'vincolante Biotag-Bira embrioni transgenici ed esaminare l'anatomia vascolare. La generazione di modelli eterozigoti e omozigoti mouse può essere utilizzato anche come un surrogato per studi su modelli tumore volti a definire la natura quantitativa degli ultrasuoni molecolare – un punto di riferimento importante nel tradurre questa tecnica per la clinica.
<p class = "jove_content"> Le microbolle sono più frequentemente introdotta per la circolazione embrionale tramite iniezioni intra-cardiaca in singoli embrioni esposti attraverso una laparotomia 8-10. In iniezioni utero, tuttavia, affrontare una serie di sfide. Questi includono una guida di iniezione, la necessità di contrastare il movimento nella madre ed embrione esteriorizzato, manutenzione della viabilità emodinamica nella madre ed embrioni esteriorizzato, affrontando gli effetti a lungo termine di anestesia e complicazioni dovute al sanguinamento 11. Pertanto, l'obiettivo della ricerca è stato quello di sviluppare una tecnica per l'iniezione di microbolle in isolato di vita in fase avanzata di embrioni 12. Questa opzione offre maggiore libertà in termini di controllo dell'iniezione e posizionamento, riproducibilità del piano di imaging senza ostacoli, e analisi di immagine semplificata e quantificazione.Nel presente studio, si delineano una nuova procedura per l'iniezione di microbolle in vita embrioni murini for fini di studio del comportamento cinetico microbolle e di studiare legame marcatori di superficie endoteliali endogeni microbolle mirati. Contrasto non lineare specifica ecografia viene utilizzato per misurare una serie di parametri di perfusione di base tra cui la valorizzazione di picco (PE), lavare-in rate e il tempo di picco (TTP) in isolati embrioni E17.5. Abbiamo inoltre dimostrato la validità del modello dell'embrione per valutare la natura quantitativa degli ultrasuoni molecolare in una perdita endoglin embrionale di modello di topo transgenico funzione, dove endoglin è un obiettivo clinicamente rilevante a causa della sua elevata espressione in cellule endoteliali vascolari in siti di angiogenesi attiva 13 . L'adesione di endoglin mirati (MB E), topo IgG 2 di controllo (MB C) e non mirati (MB U) microbolle viene valutato in endoglin eterozigoti (Eng +/-) e endoglin omozigote (Ita + / +) esprimendo embrioni. Analisi della bindi miratang rivela che gli ultrasuoni molecolare è in grado di distinguere tra genotipi endoglina e relativa densità dei recettori per i livelli quantificabili ultrasuoni molecolare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mezzi di contrasto ecografici sono state iniettate in fase tardo-embrioni di topo di gestazione e le immagini di contrasto non lineari sono stati acquisiti per misurare parametri di perfusione e mirato microbolle vincolanti. Immagini di successo di microbolle all'interno di vasi embrionali era dipendente da una serie di fattori, il primo embrione di essere redditività. Tutte le attrezzature ed apparecchi sono stati preparati in anticipo in modo da minimizzare il tempo necessario per l'isolamento di embrioni dal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Terry Fox Program of the National Cancer Institute of Canada.
Materials
| Reagents | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Antibodies (biotinylated, eBioscience) | Antibody choice depends on the experiment | ||
| rat isotype IgG2 control | eBioscience | 13-4321-85 | This antibody/microbubble combination is often required as experimental control |
| biotin anti-mouse CD309 | eBioscience | 13-5821-85 | |
| Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin | In house hybridoma | Outside antibodies may also be appropriate: we have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past | |
| Distilled water | |||
| Embryo media | |||
| 500 mL Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose | Sigma | D5796 | |
| 50 mL Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | lot # 7592456 |
| Hepes | Gibco | 15630 | 5mL, 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mL, 10,000 units Pen., 10,000 ug Strep |
| Ethanol, 70% | |||
| Ice | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | 4% |
| Phosphate Buffered Saline [1x] | Sigma | D8537 | 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride |
| Pregnant mouse, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| 0.9% sodium chloride (saline) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted | MicroMarker; VisualSonics Inc. | ||
| Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Cell culture plates (4) : 100×20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Cell culture plates (12) : 60×15 mm | Sigma | D8054 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT centrifuge | ||
| Conical tubes, 50 mL BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluent | Beckman Coulter | Isoton II Diluent, 8448011 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Forceps (2), Dumont SS (0.10×0.06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Forceps, splinter | VWR | 25601-134 | |
| Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) | VWR | 89000-216 | |
| Glass capillaries, 1×90 mm GD-1 with filament | Narishige | GD-1 | |
| Glass needle puller | Narishige | PN-30 | |
| Gloves | Ansell | 4002 | |
| Gross anatomy probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hot plate | VWR | 89090-994 | |
| Ice bucket | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imaging Platform | VisualSonics Inc. | Integrated Rail System | |
| Light source, fiber-optic | Fisher Scientific | 12-562-36 | Ideally has adjustable arms |
| Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Micro-ultrasound system, high-frequency | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Needles, 21 gauge (1”) | VWR | 305165 | |
| Particle size analyzer | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
| Perforated spoon (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettors [2-20 uL, 20-200uL, 100-1000uL] | Eppendorf | Research Plus adjustable 3120000038; 3120000054; 3120000062 | |
| Pipettor tips [2-200uL, 50-1000uL] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; 022491351 | |
| Scissors | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Tubing, Tygon laboratory 1/32×3/32” | VWR | 63010-007 | |
| Wooden applicator stick (swab, cotton head) | VWR | CA89031-270 | |
| Surgical microscope 5-8x magnification | Fisher Scientific | Steromaster | |
| Syringes, 1 mL Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| Syringes (10), 30 mL | VWR | CA64000-041 | |
| Syringe infusion pump | Bio-lynx | NE-1000 | |
| Thermometer, -20-110oC | VWR | 89095-598 | |
| Timer | VWR | 33501-418 | |
| Tubes, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Tube racks (3) | VWR | 82024-462 | |
| Ultrasound transducer, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tubingen, angled up | Fine Science Tools | 15005-08 |
References
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