Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.
Reduceret rygmarv blodgennemstrømning (SCBF) (dvs. iskæmi) spiller en central rolle i traumatisk rygmarvsskade (SCI) patofysiologi og er derfor et vigtigt mål for neurobeskyttende terapier. Selvom flere teknikker er blevet beskrevet for at vurdere SCBF, de alle har væsentlige begrænsninger. At overvinde den sidstnævnte, vi foreslår brugen af real-time kontrast forstærket ultralydsscanning (CEU). Her beskriver vi anvendelsen af denne teknik i en rotte kontusion model af SCI. En jugular kateter først implanteres for gentagen injektion af kontrastmiddel, en natriumchloridopløsning af svovlhexafluorid indkapslede mikrobobler. Rygsøjlen derefter stabiliseret med en skræddersyet 3D-ramme og rygmarven dura mater er udsat af en laminektomi på ThIX-ThXII. Ultralydsonden placeres derefter på den posteriore side af dura mater (overtrukket med ultralyd gel). For at vurdere baseline SCBF, en enkelt intravenøs injektion (400 ul) af contrast påføres på optage dens passage gennem den intakte rygmarv mikrovaskulaturen. En vægt-slip enhed efterfølgende anvendes til at generere en reproducerbar eksperimentel kontusion model af SCI. Kontrastmiddel er re-injiceres 15 min efter skaden for at vurdere post-SCI SCBF ændringer. CEU muliggør realtid og in vivo vurdering af SCBF ændringer efter SCI. I skadede dyr, ultralydsscanning viste ujævne blodgennemstrømning langs intakte rygmarven. Endvidere 15 min post-SCI, der var kritisk iskæmi på niveau med epicentret mens SCBF forblev bevaret i de mere fjerntliggende intakte områder. I regionerne støder op til epicentret (både rostralt og caudal) blev SCBF væsentligt reduceret. Dette svarer til den tidligere beskrevne "iskæmisk penumbraen zone". Dette værktøj er af stor interesse for at vurdere virkningerne af behandlinger der tager sigte på at begrænse iskæmi og den resulterende vævsnekrose efter SCI.
Traumatisk rygmarvsskade (SCI) er en ødelæggende tilstand, der fører til en betydelig forringelse i motor, sensoriske og autonome funktioner. Til dato har ingen behandling vist sin effektivitet i patienter. For sådan grund er det vigtigt at identificere nye teknikker, der vil forbedre vurderingen af potentielle behandlinger og kan yderligere belyse skade pathiophysiology 1.
SCI er opdelt i to på hinanden følgende faser, betegnet som primære og sekundære skader. Den primære skade svarer til den oprindelige mekaniske skade. Mens de sekundære skade grupperne en kaskade af forskellige biologiske hændelser (såsom inflammation, oxidativt stress og hypoxi), der yderligere bidrager til gradvis udvidelse af den oprindelige læsion, vævsskade og derfor neurologisk underskud 2,3.
På den akutte fase af SCI, er neurobeskyttende behandlinger til formål at reducere den sekundære skade patologi og shOuld derfor forbedre neurologiske udfald. Blandt de mange sekundære skade begivenheder, iskæmi spiller en afgørende rolle 4,5. På niveau med SCI epicenter, de beskadigede parenkymale mikrokar hæmme den effektive rygmarv blodgennemstrømning (SCBF). Desuden er SCBF også reduceret betydeligt i området omkring skaden epicentret, et område specifikt kendt som "iskæmiske penumbraen zone". Hvis SCBF ikke hurtigt kan genoprettes inden for disse områder, kan iskæmi føre til supplerende parenchymal nekrose og yderligere nervøs vævsskade. Da selv den mindste vævskonservering kan have betydelige virkninger af funktion, er det af stor interesse for at udvikle lægemidler og behandlingsformer, der kan reducere iskæmi post-SCI. For at fremhæve dette fænomen, har tidligere arbejde vist, at bevarelsen af kun 10% af myelinerede axoner var nok til at tillade gå hos katte efter SCI 6.
Selvom flere teknikker er blevet beskrevet for at vurdere SCBF, deny har alle væsentlige begrænsninger. For eksempel anvendelse af radioaktive mikrosfærer 7,8 og C14-iodopyrine autoradiografi 9 kræver efterfølgende dyr offer og kan ikke gentages på senere tidspunkter. Brint clearance teknik 10 afhænger af indføring af intraspinale elektroder, som yderligere kan beskadige rygmarven. Mens laser Doppler imaging, fotoplethysmografi 14,15 og in vivo lysmikroskopi 16 har en meget begrænset dybde / område måling 11-13.
Vores team har tidligere vist, at kontrastforbedret ultralyd (CEU) billeddannelse kan anvendes til at vurdere realtid og in vivo de SCBF ændringer i rotte rygmarven parenkym 17. Det er vigtigt at bemærke, at en lignende teknik blev anvendt af Huang et al. I et porcint model af SCI 18. CEU anvender en bestemt form for ultralydsscanning, som gør det muligt at knytte gråtoner morfologiske imaldre (fremstillet ved den konventionelle B-mode) med rumlige fordeling af blodgennemstrømningen 19. Den SCBF billedbehandling og kvantificering afhængig intravaskulær injektion af ekko-kontraststoffer. Kontrastmidlet består af svovlhexafluorid mikrobobler (gennemsnitlig diameter på omkring 2,5 um og 90% har en diameter mindre end 6 um) stabiliseret med phospholipider. Mikroboblerne afspejler ultralydsstrålen, der udsendes af sonden dermed øge ekkoet fra blod og øge kontrasten af vævene efter deres blodgennemstrømning. Det er derfor muligt at vurdere blodstrøm i et givet område af interesse ifølge intensiteten af det reflekterede signal. Mikroboblerne er også sikre, og de er blevet klinisk anvendt i mennesker. Den svovlhexafluorid hurtigt ryddet (middel terminal halveringstid er 12 min) og mere end 80% af den administrerede svovlhexafluorid genfindes i udåndingsluften inden for 2 min efter injektion. Denne protokol giver en enkel måde at bruge CEU imaging at vurdere SCBF forandringer hos rotter.
Selv om vi har beskrevet, hvordan man bruger CEU i en rotte SCI kontusion model, kan denne protokol modificeres til at passe andre eksperimentelle mål eller SCI-modeller. Vi har valgt at måle SCBF på kun to tidspunkter (før skade og 15 min post-SCI), men antallet af tidspunkter og forsinkelsen mellem SCBF målinger kan tilpasses til at opfylde behovene i andre undersøgelser. For eksempel i vores tidligere arbejde 17 har vi målt SCBF på fem på hinanden følgende tidspunkter under hele den første time …
The authors have nothing to disclose.
We acknowledge Stephanie Gorgeard, Thierry Scheerlink (Toshiba France), and Christophe Lazare (Bracco France).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Comments/Description | |
External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |