Contraste melhorado Ecografia de Avaliação da Medula Espinhal fluxo de sangue em Experimental lesão medular
Summary
Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.
Abstract
Redução do fluxo de sangue da medula espinal (FSME) (isto é, isquemia) desempenha um papel-chave na lesão traumática da medula espinal (SCI) patofisiologia e é, portanto, um importante alvo para terapias neuroprotectores. Embora vários técnicas tenham sido descritas para avaliar FSME, todos eles têm limitações significativas. Para superar este último, propomos o uso de tempo real de imagens de contraste melhorado ultra-som (CEU). Aqui nós descrevemos a aplicação desta técnica em um modelo de rato de contusão SCI. Um cateter jugular é implantada em primeiro lugar para a injecção repetida do agente de contraste, uma solução de cloreto de sódio de hexafluoreto de enxofre microbolhas encapsuladas. A coluna é então estabilizada com um 3D-frame feito por encomenda e da medula espinhal dura mater é exposto por uma laminectomia em ThIX-ThXII. A sonda de ultra-sons é, então, posicionado no aspecto posterior da dura-máter (revestidas com gel de ultra-som). Para avaliar FSME linha de base, uma única injecção intravenosa (400 ul) de contrapartidaagente é aplicado r para gravar a sua passagem intacta através da microvasculatura da medula espinal. Um dispositivo de peso-gota é subsequentemente utilizado para gerar um modelo experimental reproduzível contusão da SCI. Agente de contraste é reinjetado 15 min após a lesão para avaliar as mudanças pós-SCI SCBF. CEU permite em tempo real e in vivo avaliação de alterações SCBF após uma lesão medular. No animal ileso, ultra-sonografia mostrou fluxo sanguíneo irregular ao longo da medula espinhal intacta. Além disso, 15 minutos após a SCI, houve isquemia crítica no nível do epicentro enquanto FSME ficaram preservados nas áreas mais remotas intacta. Nas regiões adjacentes do epicentro (ambos rostral e caudal), FSME foi significativamente reduzida. Isto corresponde à "zona de penumbra de isquemia" anteriormente descrito. Esta ferramenta é de grande interesse para a avaliação dos efeitos das terapias destinadas a limitar a isquemia e necrose do tecido resultante após a SCI.
Introduction
Lesão medular traumática (SCI) é uma condição devastadora levando a prejuízo significativo no motor, sensorial e funções autônomas. Até à data, nenhum tratamento tem demonstrado a sua eficácia em pacientes. Por tal razão, é importante para identificar novas técnicas que irão melhorar a avaliação dos tratamentos potenciais e pode elucidar melhor lesão pathiophysiology 1.
SCI é dividido em duas fases sequenciais, como a que se refere a lesões primárias e secundárias. A lesão primária corresponde ao insulto mecânica inicial. Considerando que os grupos de lesões secundárias uma cascata de vários eventos biológicos (como a inflamação, o estresse oxidativo e hipóxia), que contribuem ainda mais para a expansão progressiva da lesão inicial, dano tecidual e, portanto, neurológica 2,3 déficit.
Na fase aguda da SCI, terapias neuroprotetoras visam reduzir a patologia lesão secundária e should melhorar a conformidade resultados neurológicos. Entre os muitos eventos de lesões secundárias, isquemia desempenha um papel 4,5 crucial. Ao nível do epicentro SCI, os microvasos parênquima danificadas impedir o fluxo de sangue da medula espinhal eficaz (SCBF). Além disso, FSME também é significativamente reduzida na região em torno do epicentro lesão, uma área especificamente conhecido como a "zona de penumbra de isquemia". Se FSME não pode ser rapidamente restabelecida dentro destas regiões, a isquemia pode levar a necrose do parênquima complementar e danos no tecido nervoso adicional. Como até mesmo a preservação de tecido mais leve pode ter efeitos substanciais de função, é de grande interesse para desenvolver medicamentos e terapias que podem reduzir isquemia pós-SCI. Para realçar este fenómeno, o trabalho anterior mostrou que a preservação de apenas 10% dos axônios mielinizados foi suficiente para permitir a pé em gatos pós-SCI 6.
Embora vários técnicas tenham sido descritas para avaliar FSME, oy todos têm limitações significativas. Por exemplo, o uso de microesferas radioactivas 7,8 e C14-iodopyrine autorradiografia 9 requer subsequente sacrifício dos animais e não pode ser repetido em pontos temporais posteriores. A técnica de depuração de hidrogénio 10 depende da inserção de eléctrodos intraspinal, que pode danificar ainda mais a medula espinhal. Enquanto Doppler a laser, fotopletismografia 14,15 e in vivo microscopia de luz 16 tem uma profundidade muito limitada / área de medição 11-13.
A nossa equipa foi anteriormente mostrado que o contraste de ultra-sons melhorada (CEU) de imagem pode ser usada para avaliar o tempo real e in vivo as alterações FSME no parênquima medula espinal de rato 17. É importante notar que uma técnica semelhante foi aplicada por Huang et al., Em um modelo suíno de SCI 18. CEU aplica um modo específico de imagens ultra-sónicas que permite associar tons de cinza im morfológicaidade (obtidos pelo modo B convencional) com a distribuição espacial do fluxo sanguíneo 19. A imagem SCBF e quantificação baseia-se na injecção intravascular de agentes de eco-contraste. O agente de contraste é composta por microbolhas de hexafluoreto de enxofre (diâmetro de cerca de 2,5 significa um e 90% têm um diâmetro inferior a 6 mm) estabilizada por fosfolípidos. As microbolhas de reflectir o feixe de ultra-som emitido pela sonda aumentando assim a ecogenicidade sangue e aumentar o contraste dos tecidos de acordo com o seu fluxo sanguíneo. Por conseguinte, é possível avaliar a fluxo de sangue de uma dada região de interesse de acordo com a intensidade do sinal reflectido. As microbolhas são também seguras e que têm sido clinicamente aplicada em seres humanos. O hexafluoreto de enxofre é rapidamente apagada (tempo de semi-vida terminal é de 12 min) e mais do que 80% do hexafluoreto de enxofre administrada é recuperada no ar exalado dentro de 2 minutos após a injecção. Este protocolo fornece uma maneira simples de usar CEU imenvelhecimento para avaliar as mudanças SCBF em ratos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora tenhamos descrito como usar CEU em um modelo de contusão SCI rato, este protocolo pode ser modificado para atender outros objetivos experimentais ou modelos SCI. Optamos por medir SCBF em apenas dois momentos (antes da lesão e 15 min pós-SCI), no entanto o número de pontos de tempo eo atraso entre as medidas SCBF pode ser adaptado para atender as necessidades de outros estudos. Por exemplo, no nosso trabalho anterior 17, que mediram FSME em cinco pontos de tempo sucessivos durante a primeira hora d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Stephanie Gorgeard, Thierry Scheerlink (Toshiba France), and Christophe Lazare (Bracco France).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Comments/Description | |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
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