Evaluering af Zebrafisk nyrefunktion Ved hjælp af en fluorescerende Clearance Assay

Summary

Zebrafisken er et populært værktøj til at modellere kronisk nyresygdom (CKD). Deres lille størrelse gør det imidlertid umuligt at evaluere nyrefunktionen ved hjælp af traditionelle metoder. Vi beskriver et fluorescerende farvestof nyre clearance assay ^1, der tillader kvantitativ analyse af zebrafisk nyrefunktion i CKD.

Abstract

Zebrafisken embryo tilbyder en medgørlig model til at studere organogenese og modellere menneskelig genetisk sygdom. På trods af sin relative enkelhed, den zebrafisk nyre udvikler og funktioner i næsten samme måde som mennesker. En væsentlig forskel i konstruktionen af ​​det humane nyre er tilstedeværelsen af ​​millioner af nefroner forhold til zebrafisk, der kun har to. Men forenkling et så komplekst system, i grundlæggende funktionelle enheder har hjulpet vores forståelse af, hvordan nyrerne udvikler og driver. I zebrafisk, midterlinjen placeret glomerulus er ansvarlig for den indledende filtrering blod i to pronephric tubuli, der afviger køre bilateralt ned embryonale akse, inden den brændes til hinanden på kloakken. De pronephric tubuli er stærkt befolket af bevægelige cilier, der letter bevægelsen af filtratet langs segmenterede tubulus, mulighed for udveksling af forskellige opløste stoffer, før endelig kommer ud via kloakken ^2-4. Mange gener, der er ansvarlige for CKD, including dem, der vedrører ciliogenesis, er blevet undersøgt i zebrafisk ^5. Men en større draw back har været vanskeligheden ved at vurdere zebrafisk nyrefunktion efter genetisk manipulation. Traditionelle assays til måling af nyre dysfunktion hos mennesker har vist sig ikke translationel til zebrafisk, hovedsagelig på grund af deres vandmiljø og lille størrelse. For eksempel er det ikke fysisk muligt at udtrække blod fra embryonale trinvis fisk til analyse af urinstof og kreatinin indhold, da de er for små. Hertil kommer, at zebrafisk ikke producerer nok urin til at teste på en simpel proteinuri 'oliepinden «, som ofte udføres under indledende patientundersøgelser. Vi beskriver et fluorescerende assay, der anvender optisk transparens af zebrafisk til kvantitativt at overvåge clearance af et fluorescerende farvestof, over tid, fra vaskulaturen og ud gennem nyrerne, for at give en udlæsning af nyrefunktionen ^1,6-9.

Introduction

Den humane nyre spiller en afgørende rolle i filtrering metaboliske affald fra blodet og udvinding nødvendige opløste til at opretholde cellulær homøostase. Der er en række genetiske sygdomme hos mennesker, der forårsager nyresvigt. Den mest almindelige arvelig nyresygdom er autosomal dominant polycystisk nyresygdom (ADPKD), kendetegnet ved udviklingen af ​​væskefyldte sække inden nefrotisk tubuli; skader forårsaget af cystogenesis skader nyrefunktionen ^10. ADPKD har en forekomst på 1: 800 til 1: 1.000 og udgør 8 – 10% af patienterne i slutstadiet nyresvigt (ESRF) ^11. Adskillige gener er blevet impliceret at forårsage ADPKD herunder polycystin-1 (pKD1) og -2 (PKD2), der tegner sig for ca. 85% og 15% af tilfældene henholdsvis ^12,13. Desuden genprodukterne til pKD1 og -2 lokalisere til cilium og er væsentlige for ciliogenesis ^14,15. Der er nu en anerkendt familie af humane genetiske sygdomme, kendt somde ciliopathies, som påvirker cilia funktion og resulterer i CKD ^16.

Det stigende antal humane genetiske sygdomme hos ciliaere udvikling og funktion er at trække den globale interesse for denne engang betragtet vestigial organel. Den cilium, et hår-lignende cellulære fremspring, er beriget med receptorer og ionkanaler, der er nødvendige for transduktionen af ​​vigtige celle signalering begivenheder. Den cilium består af en mikrotubulus-baserede axoneme, typisk opdelt i ni radialt anbragte mikrotubulus dubletter med eller uden en central par af singlet mikrotubuli. Den axonemal struktur definerer typen og tilstanden af ​​ciliær handling. Den 9 + 2 mikrotubuli arrangement giver motilitet til cilium hvor den er brugt i bevægelsen af ​​væsker tværs epitelial overflader. Den 9 + 0 konfiguration er ikke motil men menes hovedsageligt funktion i cellulære signaleringsbegivenheder ^17. Bortset fra CKD, konsekvenserne af ciliære dysfunktion er et sæt af karakteristiskciliopathy funktioner, der omfatter, fedme, retinal degeneration, polydaktyli og kognitiv svækkelse ^16. Men CKD er blandt de mest skadelige for patientens livskvalitet og dermed en væsentlig drivkraft bag udviklingen af relevante in vivo modeller for ciliær relaterede CKD,.

Zebrafisken er en fremragende model til at forstå ætiologien af ​​human genetisk sygdom. Deres hurtige udvikling, produktion af store antal æg, gennemsigtige væv, og ex utero vækst giver zebrafisk udviklingsprocesser skal visualiseres og biologiske begivenheder manipuleret med stor lethed. Gener kan være genetisk ændret ved hjælp af den seneste succes af genom redigeringsværktøjer (CRISPR ¹⁸ og Talens ^19), bankede ned ved hjælp antisense morpholino teknologi ^20, eller farmakologisk reguleret ved tilsætning af forbindelser til deres vandmiljøet. Faktisk zebrafisk tilbyder en platform til at foretage experiments, der ikke er eftergivende i andre dyremodeller. Mens zebrafisk er relativt simple hvirveldyr (i forhold til mennesker) de deler mange funktionelt konserverede organer, gener og signaleringsprocesser fælles med mennesker. For eksempel zebrafisk nyre er bemærkelsesværdigt ens i struktur og funktion i forhold til mennesker ^21,22. Men i modsætning til pattedyr nyre, der udvikler sig gennem en række faser, der er markeret med en mere udviklet nyre (pronephros, mesonephros og metanephros) kun embryonale zebrafisk udvikler en pronephros, de mest umodne form af en nyre. Mens millioner af nefroner kan findes danner byggestenene i pattedyrs nyre, kun zebrafisk embryo besidde to. Glomeruli, som tillader den oprindelige blod filtratet er fusioneret ved midterlinjen lige ventrale til aorta. Blodfiltre gennem glomeruli i de pronephric tubuli, der kører kaudalt langs aksen, fusing før afslutte via kloakken. Den pronephric tubules er stærkt cilierede med bevægelige cilier, som er tolerante for strømmen af filtratet i den bageste udgang ^3,4. Denne enkle pronephric struktur opretholder zebrafisk homeostase gennem flere ugers larvernes vækst, hvor de til sidst udvikler sig til en mere kompleks mesonephros struktur ^21. Imidlertid zebrafisk aldrig udvikler en metanephros ^21. På trods af de zebrafisk idiosynkrasier, er zebrafisk nephron segmenteret med genekspressionsprofiler lig, der blev observeret i pattedyr og dermed giver en uovertruffen in vivo model for nephrogenesis ^3,22.

Rutinemæssigt patienter testes for nyrefunktion gennem en række af blod og urin tests. Typisk blodet analyseres for opløste salte, urinstof og kreatinin. Høje niveauer af urinstof, kreatinin og unormale saltkoncentrationer er vejledende problemer med nyrefunktionen. Urinanalyse hjælp af en kolorimetrisk oliepinden registrerer unormale niveauer af protein, Blood, pus, bakterier og sukker til stede i urinprøver. Sådanne test kræver normalt ca. 30 ml urin eller 5 – 10 ml blod. Det har været vanskeligt at omsætte disse typer assays til lille in vivo-model organismer, såsom zebrafisk, hovedsagelig på grund af det umulige karakter samle tilstrækkeligt blod eller urin for at udføre analysen. Her fat vi manglen på egnede zebrafisk nyre funktionstest og beskrive en innovativ teknik til sin undersøgelse. Ved at injicere et fluorescerende farvestof i blodet er vi i stand til at overvåge og individuelt kvantificere over tid filtrering og udskillelse af fluorescerende aktivitet fra blodet via nyrerne. Denne metode kan bruges til at studere nyreskader forårsaget af sygdom, som vi giver et eksempel på.

Protocol

Etiske retningslinjer: Animal vedligeholdelse, dyrehold, og procedurer defineres og kontrolleres af Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986. Alle dyreforsøg er blevet udført under tilladelser, som indenrigsministeren (PIL No. 70/7892) i overensstemmelse med den biologiske Services Management Group og den biologiske Services Etisk Udvalg, SGUL, London, UK. Blev gjort alt for at nedbringe antallet af dyr, der anvendes, og at forfine både procedurer og dyrehold for at minimere lidelse og forbedre velfærden. <p cla…

Representative Results

Bardet-Biedl syndrom (BBS) er en sjælden heterogen ciliopathy, der påvirker omkring 1: 160.000 mennesker på verdensplan 16. Patienter til stede med en række tilknyttede problemer, herunder polycystisk nyrer, derefter patienter ofte kræver dialysebehandling eller transplantation 24. ESRF er den mest almindelige dødsårsag i BBS, med ca. 30% af patienter, der udvikler CKD 16. I øjeblikket har 20 ikke-relaterede gener været impliceret i BBS med ingen publicerede genotype-fænotype f…

Discussion

Zebrafisk tilbyde et værdifuldt værktøj til at modellere menneskelig genetisk sygdom, har deres anvendelse som et videnskabeligt instrument til in vivo forskning aktiveret detaljerede undersøgelser af den genetiske nedbrydning af mange biologiske systemer, herunder nyrerne. Meget er nu forstået, hvordan den zebrafisk nyre udvikler og funktioner. De slående ligheder for menneskers nephrogenesis og homologi med sygdomsfremkaldende gener ²¹ har illustreret hvordan zebrafisk er blevet grundlæggend…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404