Evaluering av Sebrafisk Nyre funksjon med en Fluorescent Lagersalg Assay

Summary

Sebrafisk er et populært verktøy for å modellere kronisk nyresykdom (CKD). Men gjør sin lille størrelse det umulig å vurdere nyrefunksjonen ved hjelp av tradisjonelle metoder. Vi beskriver et fluorescerende fargestoff nyre clearance-analyse som tillater ^en kvantitativ analyse av sebrafisk nyrefunksjon hos CKD.

Abstract

Sebrafisk embryo tilbyr en medgjørlig modell for å studere organogenesis og modellere menneskelige genetisk sykdom. Til tross for sin relative enkelhet, utvikler sebrafisk nyre og fungerer på omtrent samme måte som mennesker. En stor forskjell i konstruksjonen av det humane nyre er tilstedeværelsen av millioner av nephrons forhold til sebrafisk som har bare to. Men forenkle en så kompleks system i grunnleggende funksjonelle enheter har hjulpet vår forståelse av hvordan nyrene utvikler og drifter. I sebrafisk, er midtlinjen beliggende glomerulus ansvarlig for den første blodfiltrering i to pronephric tubuli som divergerer for å kjøre ned bilateralt den embryonale akse før den festes til hverandre ved cloaca. De pronephric tubuli er tungt befolket av bevegelige flimmerhår som letter bevegelsen av filtratet langs segmentert tubuli, slik at utveksling av ulike oppløste stoffer før slutt avslutter via cloaca ^2-4. Mange gener ansvarlig for CKD, incInkl de som er knyttet til ciliogenesis, har blitt studert i sebrafisk ^5. Men en stor trekke tilbake har vært problemer med å evaluere sebrafisk nyrefunksjon etter genetisk manipulasjon. Tradisjonelle analyser for å måle nyre dysfunksjon hos mennesker har vist seg ikke translasjonsforskning til sebrafisk, hovedsakelig på grunn av sin vannmiljøet og liten størrelse. For eksempel er det ikke er fysisk mulig å trekke ut blod fra embryonisk trinnvis fisk for analyse av urea og kreatinin-innhold, da de er for små. I tillegg trenger sebrafisk produserer ikke nok urin for å teste på en enkel proteinuri 'peilepinnen ", som ofte utføres under innledende pasientundersøkelser. Vi beskriver en fluoriserende analyse som benytter den optiske gjennomsiktigheten på sebrafisk for kvantitativt å overvåke clearance av et fluorescerende fargestoff, over tid, fra vaskulaturen og ut gjennom nyrene, for å gi en utlesning av nyrefunksjonen ^1,6-9.

Introduction

Den menneskelige nyre spiller en avgjørende rolle i å filtrere metabolske avfall fra blodet og utvinne nødvendige oppløste stoffer for å opprettholde cellulære homeostase. Det finnes en rekke genetiske sykdommer som forårsaker svikt i nyrefunksjonen. Den vanligste arvelig nyresykdom er autosomal dominant polycystisk nyresykdom (ADPKD) preget av utviklingen av væskefylte blærer i nephritic tubuli; skader forårsaket av cystogenesis er skadelig for nyrefunksjonen ^10. ADPKD har en forekomst på 1: 800-1: 1000 og står for 8-10% av pasienter i siste stadium nyresvikt (ESRF) ^11. Flere gener har vært innblandet å forårsake ADPKD inkludert polycystin-1 (PKD1) og -2 (PKD2), og står for ca 85% og 15% av tilfellene henholdsvis ^12,13. Videre genproduktene for PKD1 og -2 lokalisere til cilium og er grunnleggende for ciliogenesis ^14,15. Det er nå en anerkjent familie av menneskelige genetiske lidelser, kjent somde ciliopathies, som påvirker flimmerhårene funksjon og resultere i CKD ^16.

Det økende antall menneskelige genetiske sykdommer som påvirker stråle utvikling og funksjon er tegning global interesse i denne gang regnet rudimentært organelle. Cilium, et hår-lignende mobil utvekst, er beriket med reseptorer og ionekanaler som er nødvendige for transduksjon av viktige cellesignale hendelser. Cilium består av et mikrotubulus-basert axoneme, vanligvis strukturert i ni radielt anordnede mikrotubul dubletter, med eller uten et sentralt par av sing mikrotubuli. Den axonemal strukturen definerer type og virke ciliare handling. Den 9 + 2 mikrotubuli arrangement overfører motilitet til cilium hvor det er benyttet i bevegelse av fluider på tvers av epiteliale overflater. Den 9 + 0-konfigurasjon er ikke bevegelige, men antas å hovedsakelig funksjon i cellulære signal hendelser ^17. Bortsett fra CKD, konsekvensene av ciliary dysfunksjon er et sett av karakteristiskeciliopathy funksjoner som inkluderer, fedme, retinal degenerasjon, polydactyly, og kognitiv svikt ^16. Imidlertid er CKD blant de mest skadelig for pasientens livskvalitet og derfor en viktig drivkraft bak utviklingen av passende in vivo modeller for ciliary relatert CKD.

Sebrafisk er en utmerket modell for å forstå etiologien av human genetisk sykdom. Deres rask utvikling, tillater produksjon av store antall egg, gjennomsiktig vev, og ex utero vekst sebrafisk utviklingsprosesser som skal visualiseres og biologiske hendelser manipulert med stor letthet. Gener kan genetisk endret ved hjelp av den siste suksess av genomet redigeringsverktøy (CRISPR ¹⁸ og TALENS ^19), slås ned ved hjelp av antisense-morfolino-teknologi ^20, eller farmakologisk regulert ved tilsetning av forbindelsene til deres vannmiljøet. Faktisk, sebrafisk tilby en plattform for å gjennomføre experiments som ikke er ettergivende i andre dyremodeller. Mens sebrafisk er relativt enkle virveldyr (i forhold til mennesker) de deler mange funksjonelt konserverte organer, gener og signalprosesser i felles med mennesker. For eksempel er den sebrafisk nyre bemerkelsesverdig lik i struktur og funksjon i forhold til mennesker ^21,22. Men i motsetning til pattedyrnyre som utvikler seg gjennom en rekkefølge av faser, som hver er merket med et mer utviklet nyre (pronephros, mesonephros og metanephros), den embryoniske sebrafisk bare utvikler en pronephros, de mest umodne form av en nyre. Mens millioner av nephrons kan bli funnet danner byggesteinene i pattedyr nyre, bare sebrafisk embryo eie to. Glomeruli, som gir mulighet for den første blod filtratet blir kondensert på midtlinjen bare til ventral aorta. Blod filtreres gjennom glomeruli inn i pronephric tubuli som kjører caudally langs aksen, fusing før avslutte via cloaca. Den pronephric tubules er tungt cilierte med bevegelige cilier som er ettergivende for strømmen av filtrat inn i caudal exit ^3,4. Denne enkle pronephric strukturen opprettholder sebrafisk homeostase gjennom flere uker med larve vekst der de til slutt utvikle seg til en mer kompleks mesonephros struktur ^21. Men sebrafisk aldri utvikler en metanephros ^21. Til tross for de sebrafisk særegenheter, er sebrafisk nephron segmentert med genekspresjonsprofiler lik den som ble observert hos pattedyr og gir dermed en uovertruffen in vivo modell for nephrogenesis ^3,22.

Rutinemessig pasienter blir testet for nyrefunksjonen gjennom en serie av blod- og urinprøver. Typisk blodet blir analysert for oppløste salter, urea og kreatinin. Høye nivåer av urea, kreatinin og unormale konsentrasjoner salt indikerer problemer med nyrefunksjonen. Urinanalyse ved hjelp av en kolopeilepinnen oppdager unormale nivåer av protein, blood, puss, bakterier og sukkeret er tilstede i urinprøver. Slike tester krever normalt ca 30 ml urin eller 5 – 10 ml blod. Det har vært vanskelig å oversette disse typer av assay for små in vivo modellorganismer, slik som sebrafisk, hovedsakelig på grunn av det umulige natur samle tilstrekkelig blod eller urin for å utføre analysen. Her tar vi av mangel på egnede sebrafisk nyre funksjonstester og beskrive en innovativ teknikk for sin studie. Ved å injisere et fluorescerende fargestoff inn i blodstrømmen er vi i stand til å overvåke og individuelt kvantifisere over tid filtrering og utskillelse av fluoriserende aktivitet fra blodet gjennom nyrene. Denne metoden kan brukes til å studere nyreskade forårsaket av sykdom, som vi gi et eksempel på.

Protocol

Etikk Uttalelse: Animal vedlikehold, reindrift, og prosedyrene er definert og kontrollert av Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986. Alle dyreforsøk har blitt utført under konsesjoner gitt av innenriksminister (PIL nr 70/7892) i samsvar med biologisk Tjenester Management Group og biologisk Services Etisk Komité, SGUL, London, UK. Alle forsøk ble gjort for å redusere antall dyr som brukes og for å avgrense både prosedyrer og dyrehold for å minimere lidelse og forbedre velferden. 1. Ut…

Representative Results

Bardet-Biedl syndrom (BBS) er en sjelden heterogen ciliopathy som rammer ca 1: 160 000 mennesker verden over 16 år. Pasienten har et antall tilhørende problemer inkludert polycystisk nyrer, deretter pasienter ofte krever nyre dialyse eller transplantasjon 24. ESRF er den vanligste dødsårsaken i BBS, med rundt 30% av pasientene utvikler CKD 16. Foreløpig har 20 ikke-relaterte gener vært innblandet i BBS uten publisert genotype-fenotype forening. BBS-proteiner har felles protein loka…

Discussion

Sebrafisk gir et verdifullt verktøy for å modellere human genetisk sykdom, er deres anvendelse som et vitenskapelig verktøy for in vivo undersøkelser aktivert detaljerte studier av den genetiske nedbrytning av mange biologiske systemer, inkludert nyre. Mye er nå forstått om hvordan sebrafisk nyre utvikler og funksjoner. Den slående likheter til menneskelig nephrogenesis og homologi med sykdomsfremkallende gener ²¹ har illustrert hvordan sebrafisk er blitt grunnleggende for å forstå hvordan d…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404