Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
La microscopía confocal es el método de elección para el análisis de la localización de múltiples tipos de células dentro de los tejidos complejos, tales como la médula ósea. Sin embargo, el análisis y la cuantificación de la localización celular es difícil, ya que en muchos casos se basa en el recuento manual, teniendo así el riesgo de introducir un sesgo rater-dependiente y la reducción de la fiabilidad entre. Por otra parte, a menudo es difícil juzgar si la co-localización entre dos células resultados de posicionamiento aleatorio, especialmente cuando los tipos de células se diferencian fuertemente en la frecuencia de su ocurrencia. Aquí, se introduce un método para la cuantificación insesgada de co-localización celular en la médula ósea. El protocolo describe la preparación de la muestra utilizado para obtener secciones histológicas de los huesos largos murinos enteros incluyendo la médula ósea, así como el protocolo de tinción y la adquisición de imágenes de alta resolución. Un flujo de trabajo de análisis que abarca desde el reconocimiento de hematopoyéticas y no hemattipos de células opoietic en imágenes de la médula ósea de 2 dimensiones (2D) a la cuantificación de los contactos directos entre esas células se presenta. Esto también incluye un análisis de vecindad, para obtener información sobre el microambiente celular que rodea a un determinado tipo de célula. Con el fin de evaluar si co-localización de dos tipos de células es el mero resultado de posicionamiento celular aleatoria o refleja asociaciones preferenciales entre las células, una herramienta de simulación que es adecuado para probar esta hipótesis en el caso de hematopoyéticas, así como las células del estroma, es se utiliza. Este enfoque no se limita a la médula ósea, y se puede ampliar a otros tejidos para permitir reproducible análisis, cuantitativa de los datos histológicos.
Introduction
Debido a los rápidos avances tecnológicos recientes en microscopía, incluyendo imágenes ópticas, el análisis de las células dentro del contexto de todo el tejido se ha convertido cada vez más accesible para los inmunólogos. La caracterización de las células individuales en suspensión representa un método valioso e indispensable para entender la función celular y molecular. Sin embargo, el análisis de las células dentro de su (micro) -anatomical medio ambiente es esencial para la comprensión de las interacciones entre los diversos tipos de células que colaboran en procesos complejos, tales como el desarrollo de respuestas inmunes.
Si bien es relativamente fácil para los microscopistas para obtener información cualitativa de las imágenes, sigue siendo un desafío para cuantificar estos datos, en parte debido al hecho de que los métodos de análisis en este campo se están quedando atrás en comparación con lo que es posible en la adquisición de imágenes. Muchos investigadores todavía dependen de tiempo de conteo manual de células en sus imágenes de histología,introduciendo así un sesgo entre los diferentes evaluadores y dificultando la replicación por otros grupos. A menudo, se elige una imagen representativa para subrayar una declaración sobre la posición celular o co-localización en una publicación, por lo que es difícil para el lector a juzgar la relevancia estadística de tal evento.
Junto con el hecho de que el contenido de la información completa de los datos de la imagen raramente explotado, esto pone de relieve la necesidad de un enfoque más imparcial, rápido y completo para analizar imágenes histológicas.
La médula ósea es un tejido complejo, que lleva en funciones vitales importantes como el órgano de la hematopoyesis en los vertebrados adultos. Además de ser el lugar de nacimiento de las células hematopoyéticas 1,2 y jugar un papel importante en el desarrollo de linfocitos B 3, que también actúa como un sitio donde se inician 4 reacciones inmunes y apoya, células B maduras recirculación 5. Además, su papel en el mantenimiento imemoria mmunological cada vez más valorada en la última década, ya que se han encontrado varios tipos de células que constituyen la memoria inmune a residir allí 6-9.
La relación entre el complejo de la arquitectura del tejido de la médula ósea y sus funciones siguen siendo difícil de alcanzar. A diferencia de los órganos linfoides secundarios, que se organizan en la macro-departamentos, tales como zonas de células T y B, la médula ósea carece de una clara macro-compartimentación. Hasta ahora distintos compartimentos en la médula ósea se definen por su proximidad a la corteza del hueso o de la vasculatura. La importancia de las distintas poblaciones de células del estroma residentes en la médula ósea por una serie de procesos tales como las células madre de apoyo, el desarrollo de las células B o el mantenimiento de las poblaciones de células de memoria inmunes (tales como células de plasma de larga vida (PCs), CD4 + y CD8 + células T de memoria) indica claramente que existe un cierto grado de micro-compartimentación en la médula ósea.
<pclass = "jove_content"> Estas observaciones han llevado al concepto de nichos microanatómicos distintas, que se especializan en ciertas funcionalidades (células madre de mantenimiento, desarrollo de las células B en varias etapas, y el mantenimiento de la memoria inmunológica) en la médula ósea. Aunque parece que hay un cierto grado de heterogeneidad entre los nichos que sirven para diferentes funciones, algunos de los factores producidos por las células del estroma, como-CXC quimiocinas ligando 12 (CXCL12) o interleucina 7 (IL-7), son componentes cruciales para varios de estos nichos 10. La visualización y caracterización de células estromales en la médula ósea es difícil debido a sus características morfológicas con largos, las extensiones dendríticas delgada que forma una red a lo largo de la médula ósea, y la falta de marcadores apropiados para discriminar subpoblaciones estromales.Aún no está claro hasta qué punto estos nichos tienen características comunes con respecto a su compositio celular y molecularn, y qué elementos hacen que un determinado nicho único. Además de las células del estroma, se ha demostrado tipos de células hematopoyéticas a desempeñar un papel crucial al proporcionar ciertas señales al menos para algunos de los nichos. Claramente, la complejidad de la composición nicho requiere su análisis in situ, y se ha convertido cada vez más importante para los inmunólogos y hematólogos para hacer un zoom en la microarquitectura ósea de hueso, por ejemplo, mediante el análisis de las relaciones espaciales entre sus componentes celulares.
Aquí, una estrategia para cuantificar las relaciones co-localización y vecinales celulares en la médula ósea de una forma automática e imparcial se presenta. Un flujo de trabajo detallada, incluyendo la generación de ratones quiméricos, que alberga las células fluorescentes del estroma y células hematopoyéticas no fluorescentes, la preparación de las secciones histológicas de los huesos sin descalcificar, adquisición de imágenes confocales que cubren todo el hueso, así como el análisis de imágenes automatizado de c celularo-localización y su validación / discriminación de colocación al azar por una herramienta de simulación se proporciona (Figura 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de los avances en los métodos modernos de imagen óptica, el análisis de los datos histológicos se sigue a menudo obstaculizada por la falta de herramientas de cuantificación y métodos adecuados, o por los análisis parciales que se centran en una pequeña área de interés. El enfoque sinérgico se presenta aquí combina análisis de imagen que cubre la región entera de la médula ósea, la segmentación automática y reconocimiento de objetos de diversos tipos de células hematopoyéticas y del estroma, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Andreas Radbruch valiosa para los debates. Estamos muy agradecidos a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann y Manuela Ohde para obtener ayuda con el cuidado de animales y Robert Günther por su excelente asistencia técnica. Agradecemos a nuestros evaluadores entrenados Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florencia Pache y Katharina Cuerno para la evaluación de las muestras histológicas y Randy Lindquist para la corrección del manuscrito. Agradecemos a J. y N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, EE.UU. para anticuerpos MBP-específicos.
Este trabajo fue apoyado por DFG HA5354 / 4-1, por JIMI-una subvención red instalación central DFG para microscopía intravital y por TRR130 / TP17, y DFG PARA 2165 (HA5354 / 6-1) para AEHSZ fue apoyada por el Max Planck Internacional Escuela de Enfermedades Infecciosas e Inmunología (IMPRS-IDI), Berlín.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
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