Summary

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Published: April 08, 2015
doi:

Summary

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Abstract

Konfokal mikroskopi, kemik iliği gibi kompleks dokuların içinde çok sayıda hücre tipinde lokalizasyonu analizi için tercih edilen yöntemdir. Birçok durumda bu nedenle bir hakem-bağımlı önyargı tanıtan ve arası güvenilirlik azaltılması riskini taşıyan, manuel sayım dayanır Ancak, hücresel lokalizasyonu analizi ve ölçümü zordur. Hücre tipleri kendi oluşma sıklığı güçlü farklılık özellikle Dahası, rastgele pozisyon iki hücre sonuçları arasında eş-lokalizasyonu olmadığını değerlendirmek için genellikle zordur. Burada, kemik iliği hücre eş-lokalizasyonu tarafsız ölçümü için bir yöntem verilmektedir. protokol kemik iliği dahil tüm kemirgen uzun kemiklerin histolojik bölümleri elde etmek için kullanılan numune hazırlama, yanı sıra boyama protokolü ve yüksek çözünürlüklü görüntülerin satın açıklar. Hematopoetik olmayan HEMAT tanınması itibaren uzanan bir analiz iş akışıBu hücreler arasında doğrudan temasların miktarının 2-boyutlu (2D), kemik iliği görüntülerde opoietic hücre tipleri sunulmaktadır. Bu da belli bir hücre türü çevreleyen hücresel mikroçevresinin hakkında bilgi almak için, bir mahalle analizini içerir. Iki hücre türünün eş-lokalizasyonu rasgele hücre konumlandırma sadece sonucu veya hücreler arasında tercihli ilişkileri gösterir olup olmadığını değerlendirmek için, hematopoietik olarak stromal hücrelerin durumunda bu hipotezi test etmek için uygun olan bir simülasyon aracı, kullanılır. Bu yaklaşım, kemik iliği ile sınırlı değildir, ve histolojik verilerin tekrar üretilebilir, kantitatif analiz olanak sağlamak üzere diğer dokulara uzatılabilir.

Introduction

Nedeniyle optik görüntüleme dahil olmak üzere mikroskopi son hızlı teknolojik gelişmelere, tüm doku kapsamında hücrelerin analizi immunologlar için giderek erişilebilir hale gelmiştir. süspansiyon tek hücrelerin karakterizasyonu hücresel ve moleküler fonksiyonunu anlamak için değerli ve vazgeçilmez yöntemi temsil eder. Ancak, (mikro) ANATOMİK ortam içinde hücrelerin analizi bu tip bağışıklık tepkilerinin geliştirilmesi gibi karmaşık işlemler işbirliği çeşitli hücre tipleri arasındaki etkileşimleri anlamak için gereklidir.

Mikroskopist görüntülerden nitel bilgi elde etmek için nispeten kolay olsa da, kısmen, bu alanda analiz yöntemleri görüntü elde etme mümkündür ne göre geride gerçeğine, bu verileri ölçmek için bir sorun olmaya devam etmektedir. Birçok araştırmacı hala zaman alıcı onların histoloji görüntüleri manuel hücre sayım güveniyorböylece farklı değerlendiriciler arasında bir önyargı tanıtan ve diğer gruplar tarafından çoğaltmayı engelleyen. Çoğu zaman, bir temsilci görüntü zor okuyucu böyle bir olayın istatistiksel alaka yargılamak için yapım, bir yayında hücresel pozisyon veya ortak lokalizasyon bir açıklama altını seçilir.

Birlikte görüntü verilerinin tam bilgi içeriği nadiren istismar olduğu gerçeği ile, bu daha hızlı, tarafsız ve kapsamlı bir yaklaşım histolojik görüntüleri analiz etmek gerektiğini vurgulamaktadır.

Kemik iliği yetişkin omurgalıların hemopoeziste organı gibi önemli yaşamsal fonksiyonları alır karmaşık bir doku vardır. Hematopoetik hücrelerin 1,2 için doğum yeri olan ve B lenfosit gelişimi 3 önemli bir rol oynayan yanı sıra, aynı zamanda bağışıklık reaksiyonları 4 başlatılan ve olgun, sirkülasyon B hücreleri 5 destekleyen bir siteye olarak görür. I muhafaza Buna ek olarak, onun rolüolarak bağışıklık hafızasına sahip oluşturan çeşitli hücre tipleri 6-9 orada bulunan tespit edilmiş olarak mmunological olarak giderek artan bellek, son on yıl içinde takdir hale gelmiştir.

Karmaşık doku, kemik iliği mimarisi ve fonksiyonları arasındaki ilişki hala zor kalır. T ve B hücresi bölgeleri gibi makro bölümlerinde düzenlenir, ikincil lenfoid organların farklı olarak, kemik iliği açık bir makro bölümlere ayrılmasını yoksundur. Şimdiye kadar, kemik iliğinde farklı bölmeleri kemik korteks ya da damar yakınlıkları ile tanımlanır. Bu tür destek kök hücreleri, B hücreleri ya da uzun süreli plazma hücreleri (PC gibi bağışıklık hafıza hücre popülasyonlarında (bakımı), CD4 + ve gelişimi gibi bir dizi işlem kemik iliğinde çeşitli yerleşik stromal hücre popülasyonlarının önemi CD8 + hafızalı T hücreleri) açık bir şekilde kemik iliği mikro-bölümlendirme belirli bir derecede olduğunu gösterir.

<pSınıf = "jove_content"> Bu gözlemler, belirli işlevleri kemik iliğinde (hücre bakım çeşitli aşamalarında B hücresi gelişimini ve immünolojik hafızanın bakım sap) uzmanlaşmış farklı mikroanatomik niş kavramına yol açmıştır. Farklı işlevlere hizmet niş arasında heterojenite belirli bir ölçüde var gibi görünüyor olsa da, bu tür CXC-kemokin ligand 12 (CXCL12) veya interlökin 7 (IL-7), gibi stromal hücreler tarafından üretilen bazı faktörlerin için önemli bileşenler Bu niş 10 birkaç. Kemik iliğinde görselleştirme ve stromal hücrelerin karakterizasyonu nedeniyle uzun, ince dendritik uzantıları kemik iliği boyunca bir ağ oluşturan morfolojik özellikleri zordur, ve uygun belirteçler eksikliği stromal subpopülasyonunun ayırt etmek.

Bu nişler kendi hücresel ve moleküler Compositio açısından ortak özellikleri paylaşan ne kadar henüz olarak belli değiln ve elemanları belli bir niş benzersiz kılıyor. Stromal hücrelerin yanı sıra, hematopoietik hücre tipleri niş bazı en azından bazı sinyaller sağlayarak önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Açıkçası, niş bileşiminin karmaşıklığı yerinde kendi analizini gerektirir ve immunolojistlerden ve hematolog hücresel bileşenleri arasındaki mekansal ilişkileri analiz ederek, örneğin kemik iliği mikromimarisine, yakınlaştırmak için giderek daha önemli hale gelmiştir.

Burada, bir strateji sunulmuş bir otomatik ve tarafsız bir şekilde kemik iliğinde hücresel ortak yerelleştirme ve mahalle ilişkileri ölçmek için. Floresan hücreleri ve floresan olmayan hematopoietik hücreler, undekalsifiye kemik, bütün kemiğin kapsayan konfokal imajların ediniminin histolojik kesitlerin hazırlanması, hem de hücresel c otomatik görüntü analizine kimerik farelerin üretilmesi de dahil olmak üzere barındıran ayrıntılı bir iş akışıo-lokalizasyon ve simülasyon aracı ile rastgele konumlandırma onun doğrulama / ayrımcılık (Şekil 8) sağlanır.

Protocol

Hayvan deneyleri, hayvan refahı (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) için uygun eyalet komiteleri tarafından onaylanmış ve güncel kılavuzlarda ve yönetmeliklere (hayvan deneyi lisans G0194 / 11) uygun olarak yapıldı. Floresan Kemik İliği Kimerik Fareler 1. Nesil Not: 9 daha önce anlatıldığı gibi, kemik iliği stromal hücreleri görselleştirmek için floresan kemik iliği kimerik farelerin üretilmesi gerçekleştirilir. </p…

Representative Results

Kawamoto bant yöntemi ile undekalsifiye kemik cryosections Kesme diyafizinde gibi olan epifiz alanlarında hem de tüm kemik hala mineralize kemiğe bağlı endosteal bölgede kemik iliği, sağlam bir bölüm olarak kesilmesini sağlayan ve onların Trabeküler kemik yüksek yoğunluklu (Şekil 1). Bölümlerin Nükleer boyama hazırlanmasında küçük çatlaklar tam olarak önlenemez, ancak, sinüzoidler ve arterlerin yapısı yanı sıra parankim retiküler ağ bozulmadan kalır ortaya koymaktadır…

Discussion

Modern optik görüntüleme yöntemleri ilerlemelere rağmen, histolojik verilerin analizi hala sık sık uygun ölçüm araçları ve yöntemleri, eksikliği veya ilgi küçük bir alanda odaklanmak önyargılı analizler tarafından engellenir. Burada sunulan sinerjik yaklaşım görüntü tüm kemik iliği bölgeyi kapsayan analiz, otomatik segmentasyon ve çeşitli hematopoetik ve stromal hücre tipleri, eş-lokalizasyon analizi nesne tanıma ve Yeni müşteriler tarafından sağlanan olmayan rastgele meydana kişil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz değerli tartışmalar için Andreas Radbruch teşekkür ederiz. Biz mükemmel teknik yardım için hayvan bakımı ve Robert Günther yardım için Gruczek, Patrick Thiemann ve Manuela OHDE Sabine müteşekkiriz. Biz yazının redaksiyon için histoloji örneklerinin değerlendirilmesi ve Randy LİNGUİST için eğitimli değerlendiriciler Laura OEHME, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Floransa Pache ve Katharina Horn teşekkür ederiz. Biz MBP-spesifik antikorların J. ve N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, ABD teşekkürler.

Bu çalışma intravital mikroskopi için JIMI-bir DFG çekirdek tesisi ağ hibe ile ve ile DFG HA5354 / 4-1, tarafından desteklenen TRR130 / TP17 ve DFG AEHSZ için 2165 (HA5354 / 6-1) İÇİN Uluslararası Max Planck tarafından desteklenen Enfeksiyon Hastalıkları ve İmmünoloji (IMPRS-IDI), Berlin Okulu.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Neomycin Sigma N6386 SIGMA Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com
Ursovit AD3EC Serumwerke Bernburg 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate,  5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) Sigma P4333   Sigma     H3375   Sigma   www.sigmaaldrich.com
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin)
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg Rockland D602-0100 www.rockland-inc.com
20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) Science Services 15713 EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-Sucrose Carl Roth 4621.1 www.carlroth.com
Dry ice
Acetone Sigma.Aldrich 179124 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com
Hexane Sigma-Aldrich 208752 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com
Tissue-Tek cryomolds (standard) Sakura  4557 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com
Tissue-Tek O.C.T. Sakura  4583  www.sakuraus.com
Kawamoto's SCEM embedding medium Section-Lab, JP http://section-lab.jp/index.html
Kawamoto's cryosection preparation kit  Section-Lab, JP http://section-lab.jp/index.html
Kawamoto's cryofilm type 2C(9) Section-Lab, JP http://section-lab.jp/index.html
Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile Thermo Scientific 3052835 L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com
polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated Rockland 600-406-379 www.rockland-inc.com
Alexa Fluor 555 streptavidin Life Technologies S-32355 www.lifetechnologies.com
rat anti-MBP J. and N. Lee available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
goat anti-rat-Alexa Fluor 647 Life Technologies A-21247 www.lifetechnologies.com
rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
mouse anti-l1 light chain -FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
rat anti-k light chain – FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma D9542 SIGMA www.sigmaaldrich.com
Fluorescent mounting medium DAKO S3023 www.dako.com
Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) Carl Roth H875.2 www.carlroth.com
Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) VWR 48311-703 www.vwr.com
Laser scanning confocal microscope  equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow Wimasis, Munich The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de
VC2012 Runtime Microsoft free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679
Simulation tool for random cell positioning available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org)  
Fiji image analysis software  free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).

References

  1. Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
  2. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
  3. Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
  4. Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
  5. Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
  6. Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
  7. Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
  8. Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
  9. Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
  10. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
  11. Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in ‘knock-in’ Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
  12. Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
  13. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
  14. Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
  15. Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley … [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
  16. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
  17. Hughes, I., Hase, T. . Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).
  18. Quinn, G. P., Keough, M. J. . Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).
  19. Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
  20. MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).
  21. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  22. Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
  23. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
  24. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
  25. Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
  26. Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  27. Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).
  28. Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells – a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
  29. Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
  30. Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
  31. Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
  32. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
  33. Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).

Play Video

Cite This Article
Zehentmeier, S., Cseresnyes, Z., Escribano Navarro, J., Niesner, R. A., Hauser, A. E. Automated Quantification of Hematopoietic Cell – Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (98), e52544, doi:10.3791/52544 (2015).

View Video