Abstract
Små molekyler giver rige mål for biosensorer applikationer på grund af deres fysiologiske implikationer som biomarkører for forskellige aspekter af menneskets sundhed og ydeevne. Nukleinsyre-aptamerer er blevet mere og mere anvendt som anerkendelse elementer på biosensor platforme, men at vælge aptamere mod små molekyler mål kræver specielle design overvejelser. Dette arbejde beskriver modifikation og kritiske trin i en fremgangsmåde designet til at vælge struktur-switching aptamerer til lavmolekylære mål. Bindingssekvenser fra et DNA-bibliotek er hybridiseret til komplementære DNA indfangningsprober på magnetiske perler separeres fra nonbinders via en target-induceret ændring i konformation. Denne fremgangsmåde er fordelagtig, fordi sekvenser bindende bærermatrixen (perler) ikke vil blive yderligere forstærket, og det ikke kræver immobilisering af målmolekylet. Imidlertid er smeltetemperaturen af indfangningsproben og bibliotek holdt ved eller lidt over stuetemperatur, således at sekvenser that dehybridize baseret på termodynamik vil også være til stede i supernatanten. Dette begrænser effektivt effektivitet opdeling (evnen til at adskille målbindingssekvenserne fra nonbinders), og derfor er mange udvælgelsesrunder vil være forpligtet til at fjerne baggrunden sekvenser. Den rapporterede metode adskiller sig fra tidligere struktur-skift aptamer markeringer forbindelse med gennemførelse af negative udvælgelse trin, forenklet berigelse overvågning og udvidelse af længden af indfangningsproben efter valg berigelse at give øget stringens. De udvalgte struktur-switching aptamerer er fordelagtige i en guld nanopartikel assay platform, der rapporterer tilstedeværelsen af et target molekyle ved den konformationelle ændring af aptamer. Guldet nanopartikel assay blev anvendt, fordi det giver en enkel, hurtig kolorimetrisk udlæsning der er gavnligt i et klinisk eller indsat miljø. Design og optimering overvejelser præsenteres for analysen som proof-of-principle arbejde i buffer til at danne grundlag for yderligere forlængelse af arbejdet hen imod småmolekyle biosensorer i fysiologiske væsker.
Introduction
Små molekyler har længe været anerkendt som spiller afgørende roller i forskellige biologiske processer såsom fysiologisk toksicitet eller ernæring, cellesignalering, og som farmaceutiske behandlinger for sygdom 1. Forskellige små molekyler er også blevet foreslået som biomarkører vejledende fysiologiske betingelser, herunder stress 2,3, træthed 4, og sygdom 5. For eksempel forhøjede cortisol niveauer korrelerer med stress, som kan resultere i nedsat fysiologisk ydeevne og andre sundhedsmæssige forhold 6-8. Ligeledes variationer i forholdet mellem visse peptider i spyt er prædiktive for træthed, hvor fysiologiske manifestationer omfatter manglende koncentration, nedsat reaktionstid og nedsat kognitiv funktion 4. Derfor kan udviklingen af target-specifikke biosensorer til at overvåge niveauerne af små molekyler giver en uvurderlig parameter til vurdering af de sundhedsmæssige og ydeevne kapaciteter af en indivelle.
Historisk har lille molekyle påvisning udført ved arbejdsintensive separationsteknikker eller antistof baseret genkendelse 6,7. Mere for nylig er nukleinsyresekvenser aptamerer 9,10 opstået som genkendelseselementer der besidder tydelige fordele i forhold til antistoffer i specifikke applikationer. Med deres evne til at binde et mål varierer i størrelse fra metalioner 11 til væv 12, er aptamere været almindeligt anvendt som anerkendelse elementer i biosensorer platforme 13,14. Sammenlignet med antistoffer, er aptamerer kemisk syntetiseret, og det er derfor nemt at indføre reproducerbare kemiske modifikationer til overfladen immobilisering eller rapportering. Aptamerer kan vælges med høj målspecificitet under de ønskede betingelser ved at ændre udvælgelsen anvendte betingelser, hvorimod antistoffer er begrænset til fysiologiske betingelser 15,16. Desuden aptamerer er i stand til højere liganddensitet grund thEIR mindre størrelse, hvilket resulterer i højere mål signalerer effektivitet på en biosensor platform, og den forbedrede stabilitet aptamere tillader gentagen brug og langsigtet sensor opbevaring 16.
Aptamerer er genereret ved hjælp af en procedure kendt som SELEX, hvor en første bibliotek af sekvenser udviklet sig fra 10 13 -10 15 unikke molekyler til et beriget endelige pool indeholder flere (10 1 -10 2) sekvenser med potentiale til at binde målmolekylet. Den endelige beriget pool derefter sekventeret, og dissociationskonstanter (K D) opnået fra bindingsassays af højeste kopiantal sekvenser med målmolekylet. Udviklingen af puljen til en endelig beriget population spores ved overvågning af procentdel af puljen bindende mål i hver runde, indtil maksimal berigelse er opnået. Dette sker over flere evolutionære runder, hvor bindende sekvenser er partitioneret fra nonbinders og AMPLceret ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR). Evnen til effektivt at partitionere og fastholde bindemidler er en af de vigtigste bestemmende faktorer for effektiviteten af udvælgelse og direkte påvirker egenskaberne ved de udvalgte aptamererne 15. Opdeling fase SELEX er mere udfordrende for små molekyler, da de ikke har den størrelse eller forskellige funktionelle grupper, som hjælper opdelingen processen proteinmål 1,15. For eksempel har mange protein partitionering platforme afhængige størrelse eller ladning baseret separation, men egenskaberne af bundne DNA-small molecule mål-komplekser er generelt ikke væsentligt anderledes end ikke-bindende sekvenser, hvilket resulterer i ineffektiv opdeling 1. Alternative SELEX partitionering metoder kan involvere immobilisering eller mærkning af målet, som potentielt ændre de bindende egenskaber ved et lille molekyle. Derfor til design af en udvælgelsesprocedure generere aptamere for lille molekyle mål for Fequires særlige hensyn.
En række ændringer er blevet anvendt til den oprindelige SELEX henblik på at øge effektiviteten af opdelingen af proceduren, forbedre affinitet eller specificitet af sekvenserne i den endelige pulje, eller gøre det mere modtagelig for forskellige applikationer 15,16. En SELEX modifikation stand til at udvælge for små molekyler blev designet til at generere struktur-switching aptamerer eller aptamerer, som undergår en konformationel ændring ved at interagere med målmolekylet 17,18. I et eksempel på denne fremgangsmåde biblioteket hybridiserede til et kort stykke ikke-bindende komplementært DNA (cDNA) immobiliseret på magnetiske perler 17. Ved target binding konformationsændringen bindende sekvenser gør det muligt at dehybridize fra cDNA, frigive dem i supernatanten, mens nonbinders forbliver hybridiseret til cDNA / perler magnetisk delt og kasseres. Denne metode er Advanessant for små molekyler, fordi det ikke kræver immobilisering eller mærkning af målmolekylet for at opnå separation.
Aptamerer der er i stand til struktur-switching besidder en værdifuld funktion for enhver potentiel biosensor platform, der kræver en ændring i aptamer struktur til at detektere tilstedeværelsen af et target-molekyle. Specifikt kan aptamerer kombineres med guld nanopartikler (AuNPs) for at skabe assays, der fungerer på grundlag af struktur-switching princip at frembringe en kolorimetrisk reaktion i nærvær af målmolekylet efter salt udfordring 19,20. I et AUNP assay enkeltstrenget DNA (ssDNA) aptamer oprindeligt adsorberer til AUNP overflade og beskytter den mod salt udfordring. Tilstedeværelsen af målet inducerer en konformationel ændring i aptamer, der udsætter AUNP overflade, hvilket resulterer i en rød-til-blå farveændring efter salttilsætning. AUNP assays har også vist sig at forstærke signalet, hvor mikromolær affinitet aptamers kan detektere mål på niveauer størrelsesordener lavere end dissociationskonstanten (Kd) 21. Denne funktion er især attraktivt for små molekyler mål, hvor tilhørsforhold typisk fra lav mikromolære til millimolære koncentrationer 1,15. Generelt er assayet også hurtig og relativt enkel at udføre, fremme yderligere undersøgelse af aptamer-AUNP assays som biosensor detektion platforme.
Målet med dette arbejde er at give en universel protokol til valg struktur-skifte aptamere til små molekyler til biosensorer applikationer ved hjælp af stress markør cortisol som repræsentant molekyle. En ordning AUNP biosensor afsløring er af interesse på grund af sin enkelhed drift og kolorimetrisk udlæsning, men struktur-skift aptamere gælder for alternative sensing platform udgange, såsom elektrokemisk 22 eller fluorescens 23, der også kan registrere via en ændring i aptamer conformation ved target binding. Sammenlignet med tidligere fremgangsmåder, var flere negative selektionssystemer trin indarbejdet i designet 17,18, og en simpel UV-baserede ordning berigelse påvisning blev gennemført (figur 1). Denne protokol er i modsætning til radioliganden berigelse afsløring ordning, der anvendes i ældre metoder 17. Den foreslåede metode også indarbejdet en stigning i længden af cDNA opfangningsprober anvendt i udvælgelsen for at øge effektiviteten opdeling og effektivt tune stringensen af udvælgelsen efter maksimal berigelse blev observeret 24. Den tunet stringens føre til et lavere samlet procentdel af DNA elueres ved målet i den sidste pulje, men resulterede i højere antal af en sekvens kopi, der er bundet med øget affinitet i forhold til det højeste kopiantal sekvens fra en tidligere runde. Den højeste kopiantal sekvens fra den endelige pulje blev påsat en AUNP assay for at illustrere, at sekvensen var modtagelig for en platformder kræver en strukturændring for at angive mål bindende. Denne buffer baseret assay viser, at reaktionen fra AUNP analysen kan ændres ved at ændre tætheden af DNA påføres overfladen, og tjener som proof-of-principle arbejde at afsætte den fremtidige forskningsindsats mod at udvikle små molekyler aptamer-baserede AUNP biosensorer i fysiologiske væsker.
Protocol
1. Bibliotek og Primer design og syntese
- Design den oprindelige bibliotek og primere (dette emne er blevet grundigt undersøgt i tidligere udgivelser) 25,26.
- Syntetisere følgende sekvenser for dette studie ved anvendelse af standard phosphoramidit-kemi:
Bibliotek: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA
Forward primer: GGAATGGATCCACATCCATGG
Reverse primer: Biotin-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA - Design af cDNA bindingsprober at supplere 5'-regionen af biblioteket. Vælg den oprindelige længde ved analyse af online smeltetemperatur software til at tilvejebringe en smeltetemperatur lidt over stuetemperatur, med hver efterfølgende basis leverer en forøget smeltetemperatur.
mer Capture Probe: CCATTCC-biotin
mer Capture Probe: TCCATTCC-biotin
mer Capture Probe: ATCCATTCC-biotin
- Syntetisere følgende sekvenser for dette studie ved anvendelse af standard phosphoramidit-kemi:
- Oprens biblioteket ved standard HPLC. Afsaltning er tilstrækfaktor for primerne og indfangningsprober. Rekonstituer oligonukleotider i nuklease frit vand i den ønskede koncentration og opbevares ved -20 ° C i op til flere måneder.
2. Buffer, Bibliotek, og Prøveforberedelse
- Forbered 500 ml buffer i Millipore eller nuclease-frit kvalitet vand med koncentrationer på 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4. Filtreres buffer gennem et sterilt 0,2 um membran; opbevaring er mulig ved omgivelsesbetingelser måneder.
- Alternativt bruge andre puffere, såsom PBS (phosphatpufret saltvand), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre), etc.
- Oprettet to thermomixers; indstille en til 95 ° C og holde den anden ved omgivelsesbetingelser (~ 20 ° C i dette arbejde). Forbered en ice bucket.
- Varme / snap afkøle DNA-biblioteket ved at placere 100 pi bibliotek (~ 2,5 nmol 10 15 -10 16 sekvenser) i termomikser indstille ent 95 ° C i 5 min. Glasset anbringes på is, mens de magnetiske perler fremstilles (afsnit 3,1-3,6). Bestemme den faktiske koncentration af DNA-biblioteket ved UV-absorption ved λ = 260 nm og anvendelse af en passende omregningsfaktor til biblioteket.
- Forbered mål stamopløsninger i et medium egnet for målet opløselighed.
- Forbered 100 mM analyt lagre i DMSO. Disse bestande er levedygtige i ca. 1 måned, når de opbevares ved omgivende forhold, men forskellige mål vil demonstrere forskellige nedbrydningsprodukter profiler.
3. Fremstilling af magnetiske perler og Indledende Runde af Selection
- Vortex 6.7 x 10 8 perler / ml streptavidin-coatede magnetiske perler og fjerne 400 pi til et nyt mikrocentrifugerør. Glasset anbringes på magnet for 2 min og supernatanten fjernes.
- Vask perlerne ved at tilsætte 400 pi bindingspuffer, vortex, og opsugning af supernatanten efter anbringelserøret på magneten til at adskille perlerne. Gentag denne proces tre gange.
- Immobilisere indfangningsprobe på de magnetiske perler ved at resuspendere perlerne i 400 pi bindingspuffer med 50 um (endelig) indfangningsprobe og inkubation i 10 minutter med forsigtig omrøring på termomikser ved omgivelsesbetingelser.
- Vask perlerne tre gange med 400 pi bindingspuffer ved at gentage de vasketrin, der er beskrevet i afsnit 3.2 for at fjerne frie indfangningsprobe.
- Resuspender perlerne i 400 pi bindingspuffer. Fjern 100 pi af perlen løsning for de næste skridt, og fastholde de resterende 300 pi ved 4 ° C til brug for yderligere udvælgelsesrunder i højst tre uger.
- Vask perlerne to gange med 200 pi bindingspuffer som beskrevet i afsnit 3.2.
- Tilsæt 100 pi snap afkølet DNA fra afsnit 2.3 til de vaskede perler og inkuberes i 30 minutter med forsigtig omrøring under anvendelse af termomikser ved omgivelsesbetingelser.
NOTE: DNA-koncentrationer i de første runder er højere end efterfølgende runder for at minimere sekvens tab tidligere runder hvor unikke sekvenser teoretisk til stede. - Kvantificere DNA'et i supernatanten ved hjælp af UV-absorption som i afsnit 2.3 og trække det fra den oprindelige mængde, der tilsættes i afsnit 3.7 for at vurdere mængden af DNA bundet til perlerne.
- Vask perlerne med 200 pi bindingsbuffer efterfulgt af yderligere to vaske med 200 pi bindingsbuffer med forsigtig omrøring på et termomikser i 5 minutter ved omgivende betingelser.
- Resuspender perlerne i 200 pi 100 pM mål fortyndet i bindingsbuffer og rotere på termomikser i 30 minutter ved omgivende betingelser. Forbered arbejdsopløsninger frisk ved begyndelsen af hver dag forud for udvælgelsen fordi målet og kontrol blev observeret at aggregere ud af vandig opløsning over tid. Opbevar supernatanten, som indeholder mål-eluerede sekvenss for yderligere undersøgelse.
- Udfør negativ udvælgelse efter afslutningen af 1-2 runder ved tilsætning af 200 pi af 1 uM progesteron til perlerne fremstillet i afsnit 3.8.1. Ryst forsigtigt i 30 minutter på termomikser ved omgivelsesbetingelser.
- Brug magnetiske stativ til at fange perlerne og kassér supernatanten, vaske perlerne to gange i 200 pi bindingspuffer før cortisol tilsætning som i afsnit 3.9.
4. Berigelse Overvågning, PCR, og Single-DNA Generation
- Tilføj supernatanten løsning på et dialyse kassette til at overvåge valget berigelse. Dialyse er nødvendigt at fjerne cortisol fra den eluerede DNA fordi cortisol er til stede i meget højere koncentrationer end DNA, og har også en UV-absorption peak, der overlapper standard DNA UV λ max = 260 nm.
- Udfør dette trin hver anden runde (runder 2, 4, 6, & 8) i de tidlige runder af selektion. Det afbøder prøve loss når potentielt få kopi antal af hver sekvens er til stede (højeste diversitet). For hurtigere resultater, kan alternative metoder såsom størrelsesudelukkelse kolonner udnyttes så godt.
- Dialyse kassette med prøve i friske 250 ml bindende buffer i 2 timer ved omgivende betingelser to gange. Sæt buffer og inkuberes ved 4 ° CO / N.
- Analyser dialyserede pool ved UV-spektroskopi til at bestemme den procentdel af DNA elueres ved målet (sammenlignet med resultaterne fra afsnit 3.8).
- Der fremstilles en 3% agarosegel med 1% w / v ethidiumbromid. I dette arbejde udarbejde en gel fra 1,5 g agarose, 50 ml TAE-buffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA, pH = 8,0) og 10 pi ethidiumbromid.
- Cycle-optimere den dialyserede pool ved at udføre en lille skala PCR (5 x 50 pi alikvoter) under anvendelse af ~ 5-15 cykler. For PCR komponenter bruge 1x PCR reaktion buffer (alle slutkoncentrationer), 200 uM dNTP'er, 10% reaktionsvolumen på DNA-template, 500nM af hver primer og 2,5U-polymerase (2,5 U / pl stock).
- Run PCR under anvendelse optimerede betingelser ved 95 ° C i 2 min, efterfulgt af gentagne cyklusser af 95 ° C (30 sec), 55 ° C (30 sek), og 72 ° C (1 min) og en 72 ° C (10 min) endelig udvidelse og hold ved 4 ° C.
- Ansæt en 25 bp standard stige til sammenligning og visualisere på en gel imager. Vælg antallet af cyklusser, der giver den højeste intensitet bandet på den korrekte størrelse markør uden uønskede biprodukter.
- Analysere resultaterne af cyklussen optimering ved at kombinere 10 pi af hver PCR-cyklus med 2 pi 6x Blå / Orange loading dye, og indlæsning i 5 separate brønde i 3% agarosegel fremstillet i trin 4.4 (125 V i 45 min).
- Udfør en storstilet PCR udnytte de betingelser og passende cyklus nummer bestemt i punkt 4.5. Typisk 6-8 ml PCR-reaktioner blev forpligtet til at indhente den 1-2,5 nmol anvendes for hver runde i dette valg. Brug 8-striben rør til at forenklehåndtering af de mange rør, der er nødvendige for at udportionerer denne mængde til PCR-amplifikation.
- Forbered en 3% agarosegel som beskrevet i afsnit 4.4, og validere, at PCR-produktet bånd vises på det rigtige sted at følge trinene i §§ 4.5.2-4.5.3.
- Konvertere hele dobbeltstrenget DNA-produkt fra afsnit 4.7 til enkeltstrenget DNA ved nedenstående trin:
- Tilføj 300 pi streptavidin-coatede kugler (ikke magnetisk) til en lille søjle blokeret af fritter. Vask perlerne med 5 ml bindingsbuffer ved at fastgøre en luer-lock sprøjte og anvende let tryk på stemplet. Fjern sprøjten fra søjlen og fjerne stemplet fra sprøjten off-line efter tilsætning af hvert materiale, så perlerne ikke forstyrres af stemplet aspiration.
- Tilføj PCR-produktet og passere det gennem søjlen under anvendelse af let tryk på stemplet. Brug flere kolonner, således at ikke mere end 1-1,2 ml PCR-produkt tilsættes til hver kolonne. Kassér den endelige flow gennem eftersom DNA vil blive tilbageholdt på søjlen ved biotindelen på den anti-sense-strengen.
- Vask søjlen med 5 ml bindingsbuffer.
- Dehybridize DNA ved tilsætning af 0,5 ml 0,2 M NaOH. Opbevar eluatet da det indeholder den enkeltstrengede sense-DNA.
- Afsalte ssDNA i 0,2 M NaOH ved at tilsætte 0,5 ml til en afsaltningskolonne fremstillet ved en vask med nuclease frit vand. Kassér den oprindelige 0,5 ml væske, tilsæt derefter 1 ml nukleasefrit vand og indsamle denne afsaltet ssDNA prøve. Vil være nødvendigt for hver 0,5 ml portion Anvendelsen af flere afsaltningssøjler.
- Bestemme koncentrationen af DNA elueret ved UV-absorption ved λ = 260 nm.
- Vacuum tørre prøven og rekonstituere i et passende volumen af bindingsbuffer. Hvis der ikke var nok DNA opnået for den næste runde af udvælgelse, gentag pkt 4.6-4.9.2.
5. efterfølgende runder af Valg og sekventering
- Juster stringens udvælgelsesbetingelserne afhængigt af resultaterne af overvågningen berigelse (afsnit 4.1). Generelt gør mere stringente i successive udvælgelsesrunder for at vælge den højeste affinitet bindemiddel fra puljen.
BEMÆRK: Denne kan omfatte en kombination af at øge DNA-koncentration, øge antallet, tid eller mængde af vasketrinene faldende målkoncentration, forøgelse af koncentrationen af den negative udvælgelse forbindelsen, eller en række andre metoder 27.- Anvend passende kontrol efter behov for at sikre specificiteten af sekvenserne for målmolekylet. I dette arbejde, anvende en negativ udvælgelse molekyle (progesteron) til systemet (tabel 1), der begynder i runde 3 og stigende koncentration hele udvælgelsesproceduren. Fra runde 11 præinkuberes DNA pool for 30 minutter med 10-20 pM progesteron før immobilisering på perlerne (før afsnit 3.7). Øge længden af indfangningsproben efter maksimal berigelse observeret.
- Forbered den sidste pulje (runde 15) og andre puljer, der repræsenterer maksimalt beriget (runde 13) og minimalt beriget (runde 6) betingelserne for sekventering af PCR-amplifikation med kompatible primere og en high fidelity-polymerase.
- Opsætning af en 50 pi reaktionsvolumen ved anvendelse af slutkoncentrationer på 1x (reaktionsbuffer), 200 uM (hver dNTP), 400 nm (hver primer), 0,5 pi DNA pool og 0,5 pi polymerase. Cycle optimere for hver runde ved at følge trinene skitseret i afsnit 4.5 under anvendelse af de samme PCR-betingelser med undtagelse af en 7 min hold ved 72 ° C for den endelige forlængelse.
- Send 50 pi de fremstillede puljer til en sekventering facilitet i mikrocentrifugerør med hætter grundigt forseglet med ikke-klæbende wrap. Placer rørene i en 15 ml konisk rør pakket med bobleplast og skib O / N med isposer til sekventering facilitet.
- Bestem kopiantallet af hver sekvens at vurdere berigelse af det sekventerede pool (s).
- Brug kode-skrivning / sortering trin (se supplerende kodeks File) for næste generation sekventering data i FASTA format til at bestemme tallene frekvens / kopi af hver sekvens gentages i dataene for alle puljer leveret af sekventering anlægget:
- Analyser specificitet og affinitet af de højeste kopi nummerserier. Den type af interaktion (protein eller lille molekyle), strukturelle egenskaber aptamer upon binding og forventes affinitet vil diktere hvilken fremgangsmåde er hensigtsmæssig. Dette emne er gennemgået nærmere i en række henvisninger 1,28-30.
6. AUNP Syntese og Detection
- Syntetisere AuNPs anvender citrat reduktionsmetode 21. Bland 98 ml Millipore vand med 2 ml 50 mM HAuCl 4 og opvarmes til kogning.
- Der tilsættes 10 ml 38,8 mM natriumcitrat somsnart reflux begynder. Farve vil skifte til en rød farve efter flere minutter. Fortsæt omrøring af opløsningen i 20 min med varmen fra.
- Lad AUNP Opløsningen afkøles til stuetemperatur og filtreres gennem et 0,2 um polyester membran. Opbevar alle AUNP suspensioner i en mørk ravfarvet flaske.
- Beregn AUNP koncentration af UV-absorption ved anvendelse af ekstinktionskoefficienten for 2,4 x 10 8 L mol -1 cm -1 31. Koncentrationen var 10 nM i dette arbejde, med en størrelse på 17 ± 0,6 nm bestemt ved dynamisk lysspredning 21.
- Inkuber DNA'et med 10 nM AUNP i 1 time ved omgivende betingelser beskyttet af aluminiumsfolie. Varier mængden af AUNP at give nok løsning til at tillade alle de ønskede forsøg, der skal udføres (~ 1-2 ml). Lastetæthed af 73, 120, og 200 D / NP (DNA-molekyler pr AUNP) blev undersøgt i dette arbejde, og mængden og koncentrationen vil variere i overensstemmelse hermed.
- Fortynd DNA / AUNP opløsning 1: 1 under anvendelse af HEPES-buffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH = 7,4). Lad blandingen at ækvilibrere ved stuetemperatur dækket af aluminiumfolie.
BEMÆRK: Den tid, der kræves til dette trin skal optimeres af forskeren. I dette arbejde gange spænder fra adskillige minutter til O / N blev undersøgt. - Forbered analyt (cortisol, cholinsyre, 2-methoxynaphthalen) stamopløsninger ved 100 mm i DMSO og dæk med alufolie. Gør friske indledende løsninger forud for hvert forsøg ved fortynding af bestanden til 100 um i en 1/3 fortynding af cortisol bindende buffer (afsnit 2.1). Yderligere fortynde den oprindelige opløsning med 1/3 bindende buffer, således at et konstant volumen (10 pi) af målet tilsættes til at generere en række koncentrationer.
- Optimer saltkoncentrationen kræves ved tilsætning 80 pi af DNA / AUNP opløsning med 10 pi 1/3 bindingspuffer (benævnt "blank").
- Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur derefter tilføje forskellige mængder af NaCl solution. Kig efter den mængde salt, der inducerer en knap visuelt mærkbar forandring i retning af en blå nuance efter salttilsætning (13-40 pi 1 M NaCl anvendes i dette arbejde). Det giver et godt udgangspunkt, men kan have behov for yderligere justering efter resultaterne, herunder mål tilføjelse.
- Kombiner 80 pi af DNA / AUNP opløsning med 10 pi af målopløsningen og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. Udnyt en plade med 96 brønde og multikanalpipette at analysere flere mål koncentrationer samtidig, herunder altid en tom (afsnit 6.8).
- Tilsæt passende mængde NaCI-opløsning (13 pi 1 M NaCl blev anvendt i dette arbejde) og straks analysere absorbans ved 650 og 530 nm under anvendelse af en pladelæser.
- Plot resultaterne som forholdet mellem absorbansværdier (E 650 / E 530) versus koncentration target normaliseret i forhold til den tomme måling.
Representative Results
Den stringens af betingelserne blev oprindeligt holdt lav til at fastholde bindemidler til stede i lave kopier i de første mange runder. Den første runde, især implementeret det laveste stringens at bevare bindemidler typisk præsenteres som unikke sekvenser, hvilket fremgår af den høje cortisol og DNA-koncentrationer, og manglen på negative udvælgelse trin. Succesen med denne aptamer udvælgelse demonstreres ved udviklingen af puljer fra en lav procentdel elueres ved målet (runde 2) til en højere fraktion elueres ved målet, som er rimelig konstant i runder 12-13 (tabel 1). Denne plateau af DNA elueres ved målet er traditionelt et endepunkt i udvælgelsen ("berigelse"). Men denne fremgangsmåde yderligere rejst stringensen af udvælgelse efter berigelse ved at øge længden af cDNA indfangningsprobe (figur 1). Forlængelse denne probe forøger styrken af hybridisering mellem CDNA og pool, øge smeltetemperaturen (T m) af komplekset, og kræver en stærkere vekselvirkning mellem target og sekvens til at frigive de bindende sekvenser i opløsning. Den indledende udvælgelsesrunde gennemført en svagere cDNA interaktion skyldes en mindre G base på 5'ende af biblioteket. Dette er i overensstemmelse med de generelt lavere stringens i den første runde, og forventes ikke at få væsentlig indvirkning på andet end valget ved at tillade flere potentielle bindemidler samt baggrund sekvenser (dehybridize baseret på termodynamik) for at gå til det næste valg runde. Disse baggrund sekvenser blev minimeret som markeringen fortsatte mod berigelse ved at gennemføre højere stringens i efterfølgende udvælgelsesrunder. Når cDNA blev forlænget fra en 7-mer til en 8-mer af runde 14 er procentdelen af DNA elueret ved målet reduceret fra 15,3% til 11,1% for en T m steg fra 19,2 ° C til 26,7 ° C. CDNA'et wyderligere forlænget til 9-mer i runde 15 med en T m på 31,3 ° C, droppe det samlede elueres til 3,3%.
Yderligere oplysninger om berigelse kan opnås ved sekventering af flere puljer, både berigede og ikke-berigede eksempler med henblik på at spore progressionen af puljer i hver runde. Næste generation sekventering (NGS) har vist sig som en effektiv metode til sekventering i udvælgelse, primært fordi højere sekvens læser (samlet antal sekvenser rapporteret) opnås i forhold til Sanger sekventering. Disse højere sekvens læser fremlægge en større dækning af det samlede antal af sekvenser i puljen, hvilket giver et mere komplet billede af mangfoldigheden af sekvenser. NGS fjerner også kloning skævhed 32 og tillader sekventering af flere puljer i en enkelt batch med tilsætning af stregkoder 24,33. NGS blev anvendt til at analysere udviklingen af berigelse af tre separate puljer i dette valg prøve (figur 2). Poolsfra runde 6 (let berigelse i forhold til runde 2 af% elueres), runde 13 (højeste berigelse), og runde 15 (højeste stringens) blev valgt som repræsentative punkter af den valgte. Numrene kopi af hver unik sekvens blev plottet som en procentdel af det samlede antal sekvens læser for hver pulje. Den højest rangerede (højeste kopi nummer) sekvens kun udgjorde 0,1% af alle sekvenser i runde 6 (33.435 i alt sekvenser, 22.463 unikke sekvenser). Da puljen bliver maksimalt beriget runde 13 til de højest rangerede sekvens stiger omfatte 15,4% af hele puljen (17.681 samlede sekvenser, 2.987 unikke sekvenser), 150x højere end i runde 6 trods kun en ~ 5x forøgelse berigelse observeret ved UV . Runde 15 (28919 total sekvens læser, 2.980 unikke sekvenser) sprang til 44,9% af alle sekvenser repræsenteret ved den enkelt sekvens højest rangerede selvom overvågningen UV berigelse viste, at mængden elueres ved målet var ~ 5x lavere end for runde 13 ( Tabel 1
15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
Tidligere undersøgelser har undersøgt binding af disse to sekvenser af mikroskala thermophoresis og ligevægtsdialyse 24. Resultaterne viste signifikant cortisol bindende for sekvens 15-1 (Kd = 6,9 ± 2,8 pM ved ligevægtsdialyse; 16,177; 0,6 uM af mikroskala thermophoresis), mens minimal binding blev observeret mellem cortisol og sekvens 15-3. Dette viser, at den øgede længde af indfangningsproben runde 15 hjulpet give højere stringensbetingelser til at frasortere den højere affinitet bindemiddel. Derudover hverken sekvens påvist iagttages binding til negativ udvælgelse molekyle, progesteron, der viser, at tilsætning af de negative udvælgelse trin var gavnligt for proceduren.
Det faktum, at en højere affinitet binder opstod efter maksimal berigelse (bestemt ved den traditionelle metode til at analysere den procentvise andel af DNA elueres ved målet) efter forhøjede stringensbetingelser blev anvendt i yderligere runder af selektion validerer fremgangsmåde til forlængelse af længden af cDNA capture sonde post-berigelse. Dette resultat viser, kopiantal fra et sekventeret pool og affinitet for målet, kan kun være forbundet under visse betingelser 24,34 i conkontrast med en forudgående rapport indebærer en direkte sammenhæng 35. Det understreger også fordelen ved overvågning berigelse af NGS, snarere end udelukkende af% elueres strategi almindelige i de fleste valg, som kan variere naturligt fra den ene runde til den næste som højere stringens anvendes. ,% Elueres er imidlertid nyttig til overvågning berigelse, når lignende betingelser anvendes på tværs af flere runder. Eksempelvis runder 6-10 alle involverede lignende betingelser, uden nogen væsentlige ændringer i berigelse (tabel 1). Når dette er observeret over flere runder, er betingelserne sandsynligvis for strenge for at fremme berigelse, og forskeren skal falde stringens i den næste runde. For eksempel blev cortisol koncentration steget fra 35 pm til 100 um i runder 11-13, og den% elueres steget fra 2,5% i runde 10 til 14,5% i runde 12. Derfor% elueres kan tjene som vejledning for justering af stringens i løbet af en markering, når similar betingelser sammenlignes fra runde til runde, og kan give supplerende oplysninger til NGS til bestemmelse af et udvalg endpoint.
Sequence 15-1 blev påført en AUNP assay for at bestemme, om en sekvens er valgt på en sådan måde at frembringe en struktur-switching aptamer ville fungere i et assay, der bygger på en strukturel ændring efter targetbindende at frembringe en reaktion. Tidligere indledende undersøgelser viste, at AUNP assay med 15-1 reagerede på stress biomarkør cortisol, men ikke til to andre markører af stress, adrenalin og noradrenalin, eller cholsyre, at en markør for leversygdom strukturelt ligner cortisol 24. Svaret blev observeret i det normale spektrum af fri cortisol rapporteret i human serum (~ 150-600 nM) 6, validere, at det valgte for en strukturændring på cortisol bindende aptamer frembringer en reaktion i AUNP analysen. I denne igangværende arbejde blev karakterisering af systemet taget et skridt videre ved at justeredækningen (densitet) af 15-1 på AUNP overflade. Under anvendelse af samme sæt betingelser blev DNA dækning steg fra 73 D / NP (DNA-molekyler / AUNP), til 120 D / NP og 200 D / NP (figur 3). Cholsyre produceret en minimal reaktion, med undtagelse af 10 pM ved 200 D / NP. Svaret af analysen formindsket som dækningen blev øget som gjorde detektionsgrænserne (LOD). LOD var 29,5 nM for 73 D / NP, 145,2 nM for 120 D / NP og 27,3 uM til 200 D / NP. Dette resultat er enig med arbejdet i Smith et al., Der illustrerede, at reaktionen på en AUNP assay udnytte kokain aptameren faldt da aptameren dækning blev øget fra 60 D / NP til 300 D / NP 36. Dette indebærer, at registreringsområdet for målet af interesse kan justeres baseret på optimering af DNA overflade dækning i AUNP analysen. Dette kunne være en fordel, når man sammenligner f.eks området fri cortisol i humant serum (~ 150-600 nM) versus human spyt (~ 5-25 nM) <sup> 6,37. Mens fysiologiske væsker er langt mere kompleks end denne buffer assay, resultaterne giver en udvidelse af proof-of-principle arbejde der viser, at AUNP betingelser kan justeres afhængig af anvendelsen, og at yderligere arbejde hen imod at udvide mellemlang til biologiske væsker ville være af interesse for biosensoren samfund.
Figur 1. Oversigt over struktur-switching udvælgelsesmetode. En lille biotinyleret cDNA opfangningsprobe immobiliseres på streptavidin-coatede magnetiske perler. CDNA er komplementær til 5'-regionen af biblioteket, hybridiserer biblioteket til perlerne. Når der tilføjes mål er en konformationsændring induceret til at frigive bindingssekvenser fra perlen, så opdeling lettes ved anvendelse af en magnet. Supernatanten bibeholdes at overvåge berigelse (% DNA elueret ved the mål) ved UV efter dialyse målet fra DNA'et. Dette trin er kun nødvendigt, hvis målmolekylet absorberer i samme UV-området som DNA. Sekvenser derefter PCR-amplificeret og forberedt for den følgende runde af valget. Som markeringen skrider frem, påføres negativ selektion, hvor sekvenser eluerede ved negativ udvælgelse molekyle kasseres, og perlerne med potentielt mål bindemidler inkuberes derefter med mål. Længden af cDNA-proben forøges efter maksimal berigelse (% elueret) for at øge stringensen af valget. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse fra 24. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Omgang | [Cortisol] (uM) | [Progesteron] (uM) | Bundet DNA (pmol) | % Elueres ved Target | cDNA Længde |
| 1 | 100 | 0 | 357,57 | N / A | 7-mer |
| 2 | 50 | 0 | 145,49 | 1.4 | 7-mer |
| 3 | 50 | 1 | 188,74 | N / A | 7-mer |
| 4 | 50 | 5 | 336,4 | 2.3 | 7-mer |
| 5 | 35 | 5 | 88,05 | N / A | 7-mer |
| 6 | 35 | 10 | 303,89 | 3.1 | 7-mer |
| 7 | 35 | 10 | 255,01 | N / A | 7-mer |
| 8 | 35 | 10 | 236,81 | <td> 2.17-mer | |
| 9 | 35 | 10 | 318,95 | 2.6 | 7-mer |
| 10 | 35 | 10 | 297,18 | 2.5 | 7-mer |
| 11 | 100 | 10 | 147,61 | N / A | 7-mer |
| 12 | 100 | 10 | 154,36 | 14.5 | 7-mer |
| 13 | 100 | 10 | 150,39 | 15.3 | 7-mer |
| 14 | 75 | 20 | 247,71 | 11.1 | 8-mer |
| 15 | 50 | 40 | 409,63 | 3.3 | 9-mer |
Tabel 1. Udvælgelse progression og berigelse af% eluering 24 < strong>. N / A (Not Applicable) rapporteres for runder hvor dialyse / UV berigelse overvågning ikke blev udført i begyndelsen af udvælgelsesrunder at afbøde tabet af lav kopi nummerserier. Denne tabel er blevet genoptrykt med tilladelse fra 24.
Figur 2. Valg berigelse bestemt af næste generation sekventering (A) Runde 6.; (B) Runde 13; (C) Runde 15. Sekvenser blev rangordnet efter kopiere nummer. Den højeste kopiantal sekvens steg fra udgør en lav procentdel af hele sekventeret pool i runde 6 (0,1%) til en høj procentdel af runde 15 (44,9%) som puljen var beriget for cortisol bindende sekvenser. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse fra 24.ET = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. AUNP assay respons fra varierende aptamer 15-1 dækning. Densiteten af aptamer inkuberet med AuNPs blev øget fra 73 D / NP (rød trekant), til 120 D / NP (grøn firkant) og 200 D / NP ( blå cirkel). Cortisol reaktioner er dristige farver, cholinsyre reaktion er i lyse farver. Analysesvaret forbedres for cortisol ved lavere tætheder, hvilket sænker LOD og udvalget målet kan påvises inden for. Betingelserne med den højeste cortisol respons (73 D / NP) blev yderligere karakteriseret i det lineære område for at give flere point inden for det forventede normale spektrum af fri cortisol rapporteret i human serum (~ 150-500 nM) og spyt (5-25 nM ) 6,37. Den minimale respons cholsyre anvende de samme 73 D / NP betingelser har væreen detaljeret i tidligere arbejde 24. Alle plots repræsenterer middelværdien ± SEM for dobbelt eller tredobbelt målinger.
. Figur 4. Repræsentative resultater fra PCR-cyklus optimering fra venstre til højre brøndene repræsenterer: 4 cyklusser, 6 cyklusser, 8 cykler, 10 cykler, 12 cyklusser, negativ (ingen DNA-template), 25 bp DNA stigen standard. Optimale betingelser er observeret ved 8 cyklusser, hvor det enkelte produkt bandet er ved høj intensitet uden over-forstærkning produkter til stede ved højere cykler.
Figur 5. AUNP assay inkubationstid optimering. Inkubationstiden for AUNP / DNA-trin ved 73 D / NP blev reduceret fra O / N (figur 3) til 30 min, og målet INCUbation blev straks efterfulgt af salttilsætning snarere end efter 20 min (figur 3). (A) en reaktion observeres for cortisol (blå diamanter), men ikke for cholsyre (grønne cirkler) eller 2MNP (2-methoxynaphthalen; røde firkanter). Alle plots repræsenterer middelværdien ± SEM for dobbelt eller tredobbelt målinger. (B) Fra venstre mod højre: blank, 10 uM cortisol, 10 uM cholsyre, 10 uM 2MNP. Visuel forandring kan iagttages med det blotte øje for cortisol. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Det faktum, at små molekyler er af biologisk interesse, men kun udgør 19% af alle aptamere indberettede gør, som sigter til udvælgelse aptamerer, der gælder for små molekyler af stor betydning. SELEX af små molekyler er særligt udfordrende som færre funktionelle grupper, strukturelle motiver og areal er til rådighed for interaktion med sekvenser i forhold til proteiner 1, og det er blevet anslået, at mindre end 30% af markeringer for alle mål forsøgte har resulteret i en aptamer 38. Derfor skal man være exceptionelt klar over eksperimentelle design og udførelse for at kunne vælge en aptamer til et lille molekyle target.
Aptameren udvælgelsesmetode er beskrevet i dette arbejde er fordelagtig, fordi den er anvendelig til små molekyler uden at kræve nogen kemisk modifikation, der kan ændre deres bindende egenskaber. Det er også eluering baseret, hvilket betyder, at eftersom than DNA, snarere end målet, indledningsvis bundet derefter elueret fra de magnetiske perler ved målet, DNA interagere med perlen matrix vil ikke blive amplificeret for næste udvælgelsesrunde, fordi bindemidler til molekylet af interesse frigives i supernatanten buffer og ikke-specifikke matrix bindemidler forbliver bundet. Omvendt er en negativt udvælgelsesmetode mod matricen for metoder, der immobilisere målet på den faste bærer hver runde, fordi DNA, der interagerer med matrixen vil blive forstærket i tillæg til de målrettede bindemidler 1. Den nuværende fremgangsmåde er udformet som et T m begrænset udvalg strategi. Dette betyder, at T m af cDNA / pool hybridisering blev holdt tæt på stuetemperatur. Morse anvendes en lignende strategi, men anvendte en 6-mer-cDNA-probe med en T m <10 ° C med udvælgelse betingelser ved 4 ° C 17. Vores ansøgning var for en biosensorer assay udføres ved stuetemperatur, så længden af cDNA blev justeret ifølgely. Dette holder stringens af markeringen så lav, at potentielle bindemidler ikke går tabt, fordi målet bindingsinteraktionen forekommer i et fjerntliggende sted, der ikke inducerer en konformationsændring stand til at afbryde cDNA binding. Men effektivitet opdelingen af den foreslåede metode er lav, fordi nogle sekvenser vil dehybridize alene baseret på termodynamik. I modsætning hertil Nutiu et al. Anvendt en 15-mer-cDNA, og var kun i stand til at identificere aptamere for to af de fire mål, muligvis fordi Tm af de 15-mer var for høj til at tillade en frigivelse af en lille molekyle mål 18.. Derfor, mens den aktuelle markering strategi vil kræve mange runder for at fjerne baggrunden sekvenser, ved at styre stringens udvælgelse og minimere tab af potentielle bindere sandsynligheden for succes vil blive øget.
Mange forskere nye til aptamer udvælgelse er uvidende om vigtige aspekter i forbindelse med PCR afpotentielle bindemidler. Cycle optimering (afsnit 4.5) er nødvendig, fordi over-forstærkning af DNA-biblioteker producerer uønskede biprodukter (typisk større i størrelse) ved høje tal cyklus, og det ønskede produkt kan helt forsvinde med et overskud på kun 5 cyklusser 39. I tilfælde af over-amplifikation PCR-produkterne ikke længere udgør de sekvenser elueret ved målet, og chancerne for udvælgelse succes er betydeligt formindsket. Figur 4 illustrerer et eksempel på cyklus optimering fra runde 5 i dette arbejde. Den laveste cyklus producerer en minimal produkt band, bandet stigninger i mængden gennem 8 cykler; ved 10 cykler bandet begynder en overgang til en højere størrelse over-forstærkning produkt, og er næsten udelukkende består af over-amplificerede produkt inden for 12 cyklusser. En anden detalje, som mange forskere uerfarne i SELEX kan overse er, at hele puljen skal forstærkes i stor skala PCR-amplifikation (afsnit 4.6) i granst rundt for at afbøde tabet af bindemidler. Antallet af unikke sekvenser muligt fra oligonucleotider er 4 N, hvor 4 repræsenterer de fire nukleinsyrebaser, og N er antallet af baser i tilfældig region af biblioteket. For dette arbejde, N = 40, hvilket resulterer i en sekvenser rum på 1,2 x 10 24 mulige unikke sekvenser. 2,5 nmol bibliotek anvendt i den første runde af selektion svarer til ~ 10 15 molekyler, hvilket betyder, at hver kopi af DNA sandsynligvis er repræsenteret i den oprindelige pulje som en unik sekvens. Derfor skal hele mængden af DNA elueres fra perlerne ved målet forstærkes at beholde en kopi af hver enkelt potentiel bindemiddel til næste runde i udvælgelsen. Når denne indledende forstærkning har fundet sted, kan vælges i følgende runder, hvor der er antaget med prøveudtagning en homogen opløsning flere kopier.
Koncentrationen af mål, bør også overvejes nøje i hver runde. Nutiu et al. Brugda koncentration på 1 mM mål gennem hele udvælgelsesprocessen, og valgt en ATP aptamer med K d = 600 pM 18. Både den nuværende arbejde og forskning i Morse 17 begyndte med 100 uM mål, faldende gennem hele markeringen, og resulterede i aptamere med lave mikromolære tilhørsforhold. Præcis hvilke runde stringens bør øges (lavere koncentration mål) afhænger af, hvornår berigelse overholdes. Et andet afgørende skridt er at anvende passende negative selektionssystemer trin, så aptamerer påvise specificitet til målmolekylet. Som anvendes kontroller er betinget af den tilsigtede anvendelse af den valgte aptameren. For eksempel blev aptamer 15-1 designet til at fungere som en anerkendelse element i en biosensorer assay for cortisol, så progesteron blev anvendt som en negativ udvælgelse molekyle, fordi det er en metabolisk precursor for cortisol, der findes i fysiologiske væsker 40. ATP aptamer udvalgt af Nutiu et al. </ Em> ikke omfatter et negativ udvælgelse skridt, og interagerer med lignende struktur molekyler, herunder ADP, AMP, adenosin, og dATP 18.
En sidste bemærkning til overvejelse er, at AUNP analysen ofte kræver en betydelig optimering for hver aptamer / målpar. Leder du efter den mængde salt, der inducerer en knap visuelt mærkbar forandring i retning af en blå nuance efter salttilsætning er et godt udgangspunkt, men justering af udgangspunktet kan være forpligtet til at overholde et svar. Vi har også fundet, at assayet producerer drastisk forskellige reaktioner afhængig af koncentrationen buffer (udvælgelse buffer kan kræve fortynding fordi den høje saltkoncentration af buffere ofte forårsager aggregering) og sammensætning, grad af DNA dækning (figur 3), prøveforberedelse (nogle organiske opløsningsmidler anvendes til at opløse målet kan forårsage en høj baggrund, som maskerer målrette respons), temperatur, salt type og koncentration og INCUBAtion tid (både DNA med AUNP og DNA / AUNP med mål). Under fuldt optimerede betingelser, er resultaterne typisk observeres med et mål inkubationstid <5 min, hvilket viser fordelen ved en hurtig mål reaktion på AUNP biosensorer platform. For eksempel i figur 5 inkubationstiden for aptamer / AUNP trin blev reduceret fra O / N (figur 3) til 30 min, og salt blev tilsat øjeblikkeligt (<10 sek) efter mål tilsætning snarere end 20 min senere (figur 3 ) ved en belastning densitet på 73 D / NP. Dette øgede cortisol reaktion på ~ 82% højere end den tomme (figur 5A) ved en koncentration 10 pM mål versus ~ 40% ved anvendelse af de tidligere betingelser (figur 3). Denne reaktion kan skelnes med det blotte øje (figur 5B). Bemærk, at det lineære område af cortisol detektion er anderledes end ved hjælp af de tidligere betingelser, hvilket tyder på, at disse betingelser kan optimeres til en ønsketdetekteringsområde. Cholsyre og 2-methoxynaphthalen (2MNP) kontrol førte ikke til en signifikant respons (figur 5A-B). Forskerne skal være klar over at reducere disse inkuberingstider kan fremme øget respons af analytter med AUNP overflade, som kan bidrage til den samlede forbedrede signal (mål) eller baggrund (uden for målgruppen molekyler). Derfor er det nødvendigt forsigtig AUNP assay design og ydeevne karakterisering for hver aptamer / målpar.
Denne procedure beskriver en protokol til valg af små molekyler struktur-switching aptamerer, der fungerer i en biosensorer platform som beskrevet AUNP assay, som kræver en konformationsændring af DNA til at påvise tilstedeværelsen af målet. Imidlertid kunne denne metode anvendes på andre biosensor systemer såsom elektrokemisk eller fluorescens, der fungerer på samme præmis for stort set alle mål størrelse. Den effekt af protokol kan videreudvikles eksperimentelt vedflere tilgange. For det første kan udvælgelsen selv potentielt forbedres ved at undersøge metoder til optimering såsom fastlæggelsen ideelle Tm af cDNA / library hybridisering, der giver en interaktion, der er svag nok til at interagere med et lille molekyle mål, men stærk nok til at reducere mængden af baggrunden sekvenser udelukkende dehybridized fra termodynamik. Dette vil kondensere antallet af cykler, der er nødvendige for udvælgelse, hvilket sparer tid i arbejdskraft og reducerende reagens forbrug. Yderligere undersøgelser modifikationer til udvælgelse ville være at bestemme de mest fordelagtige koncentrationer af perler og DNA, således at en forskelligartet population af sekvenser er eksponeret til målet, især i den indledende runde. Succesen af disse proof-of-principle eksperimenter giver et fundament til at investere yderligere midler til at optimere og tilpasse AUNP buffer analysen til fysiologiske væsker. Der er et legitimt behov for en hurtig, robust biosensorer platform, der kan function som et diagnostisk redskab af den fysiologiske tilstand af en individuel, og yderligere udvikling af AUNP assay i humant serum, ville sved eller spyt opfylde en denne aktuelle hul.
Disclosures
Distribution Statement A: frigive til offentligheden; fordeling er ubegrænset (88 ABW-2014-4103). Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads M280 Streptavidin | Invitrogen | 112.06D | Compatible with DynaMag-2 Magnet |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin |
| Streptavidin Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5113-01 | This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | ≥98% |
| Progesterone | Sigma | P0130 | ≥99% |
| Cholic Acid | Sigma | C1129 | ≥98% |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | ND-1000 | Replaced by ND-2000 model |
| Tris Base | Promega | H5135 | ≥99.9% |
| Sodium Chloride | Sigma | S9888 | ≥99.5% |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% |
| 500 ml Filter System | Corning | 430769 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| DNA Library | Operon | Custom | HPLC purified |
| All other DNA | IDT | Custom | Capture probes and primers — desalted; Aptamers — HPLC |
| Thermomixer | Eppendorf | R | Any model with temperature and mixing speed control will work |
| PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn | Agilent | 600674 | Taq polymerase can be used as well |
| Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade | Agilent | 200415 | Other brands will work here |
| 10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer | Agilent | 200532 | This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase |
| GeneAmp PCR System | Applied Biosystems | 9700 | Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work |
| Agarose-LE | Ambion | AM9040 | ≥99.9% |
| Ethidium Bromide | Sigma | E-1510 | Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen |
| Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style | Glen Research | 20-0021-01 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe |
| Replacement Filters Expedite | Glen Research | 20-0021-0F | 1 µm size |
| Illustra NAP-25 Columns | GE Healthcare | 17-0852-01 | Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | ThermoFisher Scientific | 66205 | 2k MWCO used |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important |
| Sodium Citrate Dihydrate | SAFC | W302600 | We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays |
| SpectraMax | Molecular Devices | M5 | Results were similar to Bio-TEK system |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Results were similar to Molecular Devices system |
| HEPES Buffer | Amresco | J848 | Any brand that makes a sterilized product will work |
| 250 ml Filter System | Corning | 430767 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Other brands will work here |
| 5 ml Syringe | Becton-Dickinson | 309646 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column |
| ThermoEC Minicell Primo | ThermoFisher Scientific | EC320 | Compatible with Power Supply |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB300 | Compatible with ThermoEC Minicell Primo |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | Flammable liquid |
| 2-Methoxynaphthalene | Sigma | 148245 | 99% |
| Assay Plate | Corning | 3370 | 96-well Flat Bottom, Sterile |
References
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).
- Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).
- Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress. Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).
- Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation. J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).
- Kwak, J., et al. Volatile biomarkers from human melanoma cells. J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).
- Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System. Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).
- Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor. Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).
- Kapczinski, F., et al. Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment. Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. Selection of an RNA domain that binds Zn2. RNA. 1 (5), 538-550 (1995).
- Liu, J., et al. Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue. PlosOne. 7, e37789 (2012).
- McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).
- Huang, L., et al. A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine. Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).
- Jayasena, S. D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Morse, D. P. Direct selection of RNA beacon aptamers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).
- Nutiu, R., Li, Y.
- Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem. Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).
- Li, H., Rothberg, L. J. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).
- Hagen, J. A., et al. Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation. Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).
- Han, K., Liang, Z., Zhou, N. Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors. Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).
- Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Hall, B., et al. Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- Djordjevic, M. SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways. Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).
- Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. Targeting RNA with Small Molecules. Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).
- Jing, M., Boswer, M. T. A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).
- Sachs, E. -F., Diederichsen, U. Binding of Triostin Analogues to DNA. , AN NT008. (2011).
- Liu, J., Lu, Y. Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).
- Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).
- Martin, J. A., et al. Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin. Plos One. 8 (3), e57341 (2013).
- Schütze, T., et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing. Plos One. 6 (12), e29604 (2011).
- Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing. Plos One. 6 (5), (2011).
- Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -C., Hudgens, G. A. Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).
- Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. Plos One. 5 (12), (2010).
- Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).
- Wiebe, J. P.
