Design, overflatebehandling, Cellular plating, og dyrking av Modular nevrale nettverk bestående av Funksjonelt Inter-tilkoblede kretser
Summary
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å vokse in vitro modulære nettverk bestående av romlig trange, funksjonelt inter-tilkoblet nevrale kretser. Et polymert masken blir brukt til å mønstre et proteinsjikt for å fremme cellulær adhesjon i løpet av dyrknings substratet. Belagt nevroner vokse på belagte områder etablerer spontane tilkoblinger og stiller elektrofysiologisk aktivitet.
Abstract
Hjernen opererer gjennom koordinert aktivering og dynamisk kommunikasjon av nevronale forsamlinger. Et stort åpent spørsmål er hvordan et stort repertoar av dynamiske motiver, som ligger til grunn for de forskjelligste hjernefunksjoner, kan komme ut av en fast topologisk og modulær organisering av hjernen kretser. Sammenlignet med in vivo-studier av nervekretser som presenterer eksperimentelle iboende vanskeligheter, in vitro preparater gir en mye større mulighet til å manipulere og undersøke de strukturelle, dynamiske og kjemiske egenskaper av eksperimentelle neuronale systemer. Dette arbeidet beskriver en in vitro eksperimentell metode som gjør det mulig å vokse av modulære nettverk komponert av romlig distinkte, funksjonelt sammenhengende nevronale forsamlinger. Protokollen muliggjør styring av to-dimensjonale (2D) arkitektur av neuronal nettverk på forskjellige nivåer av topologisk kompleksitet.
En ønsket nettverk mønster kan væreoppnås både på vanlige dekkglass og substrat innebygd mikroelektrode arrays. Mikro strukturer er preget på en silisiumskive og brukes til å lage biokompatible polymere stensiler, som omfatter de negative trekk ved den ønskede nettverksarkitektur. Sjablonene er plassert på dyrkingsunderlag under overflatebelegg prosedyre med en molekylsjikt for å fremme cellulær adhesjon. Etter fjerning av sjabloner blir neuroner belagt og de spontant omdirigert til de belagte områder. Ved å redusere inter-rommet avstand, er det mulig å oppnå enten isolerte eller sammenkoblede neuronal kretser. For å fremme celleoverlevelse, celler ko-dyrket med en bære neuronal nettverk som ligger ved periferien av kulturskålen. Elektrofysiologiske og optiske opptak av aktiviteten av modulære nettverk som oppnås henholdsvis ved hjelp av substrat innebygde mikroelektrodegrupper og kalsium avbildning er presentert. Mens hver modul viser spontaneous globale synkroniseringer, er forekomsten av inter-modul-synkronisering regulert av tettheten av forbindelse mellom kretsene.
Introduction
Eksperimentelle og teoretiske bevis støtter den mulighet at hjernen opererer gjennom koordinert aktivering av celleenhetene 1-5, som kan betraktes som dynamiske funksjonsenheter som transient samvirker med hverandre, forme og underliggende forskjellige hjernetilstander. Funksjonell modularitet er også avhengig av og i forbindelse med den strukturelle modulær organisering av hjernen kretser 6,7. Hvordan funksjon og struktur av hjernekretser gjensidig forme hverandre er fortsatt en av de viktigste åpne spørsmål i nevrovitenskap. Å gi en dypere forståelse av dette spørsmålet, er det viktig å identifisere optimale eksperimentelle rammeverk hvor det er mulig å ta opp, i hvert fall delvis, disse problemene. Siden kontrollert manipulering av rom-tid-dynamikk nevrale nettverk i in vivo-eksperimenter er utfordrende, utvikling av in vitro modeller nevrale nettverk er av betydelig interesse på grunn av deres enkle accessibility, overvåking, manipulasjon og modellering 8,9. I de senere årene, in vitro teknologier støttes av avanserte underlaget mønstrings metoder har lov til å indusere nevrale nettverk for å utvikle en rekke forhåndsdefinerte modulære strukturer 3 og å studere funksjonelle egenskaper nettverk med pålagte topologies 10. Spesielt ble metoder nylig brukt til å organisere nettverk ved å pålegge fysiske begrensninger 4,11. Faktisk, for å studere sammenhengen mellom struktur og funksjon i nevrale nettverk og for å gi en forenklet men plausibel representasjon av samspill nevrale forsamlinger, bør in vitro-systemer gir sammenhengende nevronale undergrupper. Allment studert 2D homogene nevrale kulturer ikke pålegge noen romlige begrensninger på selvorganisert emergent kabling av kretsene. Derfor en mulig tilnærming til å forme kunstig sammenhengende celleforsamling er å posisjonere ulike nevronale populasjoner i spyttetially forskjellige områder. Avstanden mellom disse områdene hindrer ikke inter forsamlinger tilkoblinger. Denne tilnærmingen, samtidig som man sikrer en betydelig kontroll over nettverket kompleksitet, har vist seg å gi en rikere repertoar av synkroniserings modeller 6,7,12.
For å muliggjøre en reproduserbar dyrkning av modulære neuronal sammenstillinger, til en protokoll montere selv-organisering av nevrale nettverk i klynger koblet av aksoner og dendritter er presentert og beskrevet. Polymer struktur for fysisk innesperring av nevrale kulturer har blitt opprettet fra polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS er en elastomer mye brukt for biomedisinske anvendelser på grunn av dets biokompatibilitet, transparens og permeabilitet for gasser 13. PDMS er forberedt og ekskludert fra mikromaskinert SU8 2075 14,15 strukturer av spin-belegg en flytende PDMS på en "master" som beskrevet tidligere i Jackman et al. 16 Than oppnådde mønstret nevrale nettverk er sammensatt av sammenhengende moduler av ulik størrelse, og de har blitt innhentet på begge dekkglass og Micro elektrode Arrays (måle) 17-20. Tettheten av forbindelser mellom modulene kan endre funksjonene i nettverk synkronisering, fra en fullt synkronisert nettverk, typisk for ensartede kulturer, til forbigående tilstander av synkronisering mellom modulene.
Protocol
Representative Results
Discussion
En protokoll for å vokse 2D modulære nevrale nettverk in vitro sammensatt av funksjonelt sammenhengende kretser er beskrevet. Fremgangsmåten er basert på mønstring av et cellulært klebelag. Mønster oppnås med PDMS sjablonger reprodusere den negative trekk ved den ønskede nettverksarkitektur. PDMS sjablonger definere områder hvor det cellulære klebemiddellaget er avsatt. Når cellene blir sådd ut, de spontant å sette sammen de belagte øyer og selv organisere til aktive sammenhengende kretser. Innsp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av det europeiske prosjektet BRIANBOW (FP7- Young Explorers, ville Forfatterne takke Dr. Jacopo Tessadori for nyttige kommentarer til manuskriptet, og Silvia Chiappalone for hennes hjelp i å produsere grafikk som brukes i videoen.
Materials
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
