Tasarım, Tedavi, Hücresel Kaplama ve Fonksiyonel Inter-bağlantılı Devreler oluşan Modüler Nöronal Ağları Kültüre Yüzey
Summary
Bu yazıda mekansal sınırlandırılmış işlevsel birbirine bağlı nöronal devrelerin oluşturduğu nitro modüler ağlarda büyümek için bir protokol açıklamaktadır. Bir polimerik maske kültürleme alt-tabaka üzerine hücresel yapışmayı teşvik etmek için model bir protein tabakası kullanılır. Kaplama nöronlar kaplı alanlarda kendiliğinden bağlantılarının kurulması ve elektrofizyolojik aktivite sergileyen üzerinde büyür.
Abstract
Beyin koordineli aktivasyonu ve nöronal meclisleri dinamik iletişim yoluyla çalışır. Büyük bir açık bir soru en farklı beyin fonksiyonları altında yatan dinamik motifler geniş bir repertuar, beyin devrelerinin sabit topolojik ve modüler organizasyon dışında ortaya nasıl olduğunu. Içsel deneysel zorluklar sunuyoruz nöronal devrelerin in vivo çalışmalar ile karşılaştırıldığında, in vitro hazırlıkları işlemek ve deneysel nöronal sistem, yapısal dinamik ve kimyasal özelliklerini araştırmak için çok daha büyük bir imkanı sunuyoruz. Bu eser uzamsal farklı, işlevsel birbirine nöronal meclisleri tarafından oluşan modüler ağların büyüyen sağlar bir in vitro deneysel yöntem anlatılmaktadır. protokol topolojik farklı karmaşıklık düzeylerinde nöronal ağ iki boyutlu (2D) mimarisini kontrol sağlar.
İstenilen ağ desenlendirme olabilirDüzenli kapak fişleri ve yüzey gömülü mikro elektrod dizileri hem elde etti. Mikroişlenmiş yapılar silikon gofret üzerinde kabartmalı ve istenen ağ mimarisinin özelliklerini olumsuz dahil biyouyumlu polimerik şablonlar oluşturmak için kullanılır. şablonlar hücresel yapışma teşvik etmek için bir molekül tabakası ile yüzey kaplama işlemi sırasında kültür substratlar üzerine yerleştirilir. Kalıpların çıkarılmasından sonra nöronlar plakalanır ve kendiliğinden kaplanmış bölgelere yönlendirilir. Ara bölmesi mesafeye bağlı olarak, bu izole edilmiş ya da birbirine bağlı ya da nöronal devreler elde etmek mümkündür. Hücre yaşamını destekleyen için, hücreler kültür kaplarına çevresine yerleştirilmiş olan bir destek nöronal ağ ile birlikte kültürlenmiştir. Yüzey gömülü mikro elektrot dizileri ve kalsiyum görüntüleme kullanarak sırasıyla elde edilen modüler ağların faaliyet Elektrofizyolojik ve optik kayıtlar sunulmaktadır. Her bir modül bir SPONT gösterirkenaneous küresel eşitleme arası modülü senkronizasyon oluşumu devreleri arasındaki bağlantı yoğunluğu ile düzenlenir.
Introduction
Deneysel ve teorik kanıtlar beyin geçici birbirlerine, şekillendirme ve altta yatan farklı beyin devletlerin etkileşim, dinamik, fonksiyonel birimler olarak kabul edilebilir hücre meclisleri 1-5 koordine aktivasyonu aracılığıyla faaliyet ihtimalini desteklemektedir. Fonksiyonel modülerlik de bağlıdır ve beyin devrelerinin 6,7 yapısal modüler organizasyonu ile ilişkilidir. Nasıl fonksiyonu ve beyin devrelerinin yapısı birbirini şekil hala nörobilim ana açık sorulardan biridir. Bu sorunun daha derin bir anlayış sağlamak için, o ele mümkün olduğu, en azından kısmen, bu sorunları en iyi deneysel çerçeveler belirlenmesi önemlidir. In vivo deneylerde nöronal ağların uzay-zamansal dinamikleri manipülasyon kontrollü yana in vitro nöronal ağlar modellerinin geliştirilmesi nedeniyle kolay acc önemli ilgi olduğunu, zorluessibility, izleme, manipülasyon ve 8,9 modelleme. Son yıllarda, gelişmiş alt tabaka desenlendirme yöntemleri ile desteklenen in vitro teknolojileri önceden tanımlanmış modüler yapılar 3 bir dizi geliştirmek ve dayatılan topolojilere 10 ile ağların fonksiyonel özelliklerini incelemek için nöron ağları teşvik sağladı. Özellikle, son zamanlarda yöntemler fiziksel kısıtlamaları 4,11 empoze ederek ağları düzenlemek için kullanıldı. Nitekim, nöronal ağlarda yapı ve fonksiyon arasındaki bağlantıyı incelemek ve nöronal meclisleri etkileşim basitleştirilmiş ama inandırıcı temsilini sağlamak üzere, in vitro sistemler birbirine bağlı nöronal alt-popülasyonların sağlamalıdır. Yaygın okudu 2D homojen nöronal kültürlerin devrelerin kendi kendine organize acil kablo üzerinde herhangi bir mekansal kısıtlamalar getirmez. Bu nedenle olası bir yaklaşım tükürdü farklı nöronal popülasyonlarının konumlandırmak için yapay birbirine hücre derlemeleri bir şekleially farklı alanlar. Bu alanlar arasında mesafe arası meclisleri bağlantıları engellemez. Ağ karmaşıklığını önemli bir kontrol sağlarken bu yaklaşım, senkronizasyon model 6,7,12 daha zengin bir repertuar temin etmek üzere gösterilmiştir.
Modüler nöronal düzeneklerinin tekrarlanabilir bir kültürlenmesini kolaylaştırmak için bir protokol verilmektedir ve açıklanan akson ve dendritlerin ile bağlantılı nöronal kümeler halinde ağların kendi kendine organizasyonu monte etmek. nöronal kültürler fiziksel hapsi için bir polimerik yapı polydimtheylsiloxane (PDMS) için oluşturuldu. PDMS yaygın gazların 13 olan biyouyumluluk, şeffaflık ve geçirgenlik nedeniyle biyomedikal uygulamalarda kullanılan bir elastomer. PDMS spin kaplama Jackman ve arkadaşları, daha önce tarif edildiği gibi, bir "ana" üzerine bir sıvı PDMS. 16 T 2075 14,15 yapı hazırlanmış ve Mikroişlenmiş SU8 hariç tutulmuşturO farklı boyuttaki birbirine bağlı modüllerden oluşmaktadır nöron ağları desenli başararak ve başarılı hem lamelleri ve Mikro Elektrot Diziler (ÇÇA'lar) 17-20 elde edilmiştir. modüller arasındaki bağlantıların yoğunluğu modülleri arasında senkronizasyon geçici devletlere, üniforma kültürlerin tipik bir tam senkronize ağdan, ağ senkronizasyon özelliklerini değiştirebilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fonksiyonel inter-connected devrelerden oluşan in vitro 2D modüler nöron ağları büyümeye bir protokol tarif edilmektedir. işlem, bir hücresel yapışkan tabaka desenlendirme dayanmaktadır. Desenlendirme PDMS şablonlar istenen ağ mimarisinin olumsuz özelliği üreyen ile elde edilir. PDMS şablonlar hücresel yapışkan tabaka yatırılır alanları tanımlar. Hücreler kaplama sonra, kendiliğinden kaplanmış adalar montaj ve aktif inter-connected devreler halinde kendini organize. Anlaşmalardan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Avrupa Projesi BRIANBOW (FP7- Genç kaşifler tarafından desteklenen, yazarlar yazının yararlı yorumlar için Dr. Jacopo Tessadori teşekkür etmek istiyorum, ve video kullanılan grafik üretiminde ona yardım için Silvia Chiappalone olur.
Materials
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
