Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo para crescer em redes modulares vitro que consistem em espacialmente confinados, circuitos neuronais funcionalmente inter-relacionados. Uma máscara polimérico é utilizado para uma camada de padrão de proteína para promover a adesão celular sobre o substrato de cultura. Neurônios Banhado crescer em áreas revestidas estabelecendo conexões espontâneas e exibem atividade eletrofisiológica.
Abstract
O cérebro opera por meio da ativação coordenada e comunicação dinâmica das assembléias neuronais. A questão em aberto é importante como um vasto repertório de motivos dinâmicos, que são a base mais diversas funções do cérebro, pode emergir de uma organização fixa topológico e modular dos circuitos cerebrais. Em comparação com estudos in vivo de circuitos neuronais que apresentam dificuldades experimentais intrínsecas, preparações in vitro oferece uma possibilidade muito maior para manipular e sondar as propriedades estruturais, dinâmicos e químicos de sistemas neuronais experimentais. Este trabalho descreve uma metodologia experimental in vitro que permite a cada vez maior de redes modulares compostos por, assembléias neuronais funcionalmente interligadas espacialmente distintas. O protocolo permite o controlo da arquitectura bidimensional (2D) da rede neuronal a diferentes níveis de complexidade topológica.
A padronização rede desejada pode serconseguido tanto em lamelas regulares e substrato incorporado matrizes micro eletrodos. Micromachined estruturas estão em alto relevo sobre uma bolacha de silício e utilizada para criar matrizes poliméricas biocompatíveis, que incorporam as características negativas do arquitectura de rede desejada. As matrizes são colocados sobre os substratos de cultura durante o processo de revestimento da superfície com uma camada molecular para promover a adesão celular. Após a remoção das matrizes, os neurónios são plaqueadas e eles espontaneamente redireccionado para as áreas revestidas. Diminuindo a distância entre o compartimento, é possível obter os circuitos neuronais isolados ou interligados. Para promover a sobrevivência celular, as células são co-cultivadas com uma rede neuronal de suporte, que está localizado na periferia da placa de cultura. Registros eletrofisiológicos e ópticas da atividade de redes modulares obtidos, respectivamente, utilizando substrato incorporado micro matrizes de eletrodos e de imagem de cálcio são apresentados. Enquanto cada módulo mostra espontsincronizações globais aneous, a ocorrência de sincronização entre módulos é regulada pela densidade de ligação entre os circuitos.
Introduction
Evidências experimentais e teóricas suporta a possibilidade de que o cérebro opera através da activação coordenada de conjuntos de células de 1-5, que pode ser considerado como unidades funcionais dinâmicos que transitoriamente interagem uns com os outros, para modelar e subjacentes estados cerebrais diferentes. Modularidade funcional também é dependente e associado com a organização estrutural de modular os circuitos cerebrais 6,7. Como a função e estrutura dos circuitos cerebrais mutuamente moldar o outro ainda é uma das principais questões em aberto na neurociência. Para fornecer uma compreensão mais profunda da questão, é importante para identificar estruturas experimentais ótimas, onde é possível resolver, pelo menos em parte, esses problemas. Desde a manipulação da dinâmica espaço-temporal de redes neuronais controlada em experimentos in vivo é um desafio, o desenvolvimento de modelos in vitro redes neuronais é de interesse significativo devido à sua acc fácilessibility, monitoramento, manipulação e modelagem de 8,9. Nos últimos anos, no domínio das tecnologias in vitro apoiados por métodos substrato padronização avançados têm permissão para induzir redes neuronais para desenvolver uma gama de estruturas modulares pré-definidos e 3 para estudar as propriedades funcionais das redes com topologias impostas 10. Em particular, os métodos foram recentemente usados para organizar redes através da imposição de restrições físicas 4,11. Com efeito, para estudar a relação entre a estrutura e função em redes neuronais e para fornecer uma representação simplificada mas plausível de interagir conjuntos neuronais, em sistemas in vitro devem proporcionar sub-populações neuronais interligados. Culturas neuronais homogêneos 2D amplamente estudados não impor quaisquer restrições espaciais sobre a fiação emergente auto-organizada dos circuitos. Portanto, uma possível abordagem para modelar conjuntos de células artificialmente interconectadas é posicionar diferentes populações neuronais em brigaially áreas distintas. A distância entre estas áreas não impede que as inter conexões assembléias. Esta abordagem, assegurando ao mesmo tempo um controlo considerável sobre a complexidade da rede, tem sido mostrado para fornecer um repertório mais rica de modelos de sincronização 6,7,12.
A fim de facilitar a cultura reprodutível de assembléias neuronais modulares, um protocolo para montar a auto-organização das redes em agrupamentos neuronais ligados por axônios e dendritos é apresentado e descrito. A estrutura polimérica para o confinamento físico de culturas neuronais foi criado a partir de polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS é um elastómero amplamente utilizado para aplicações biomédicas devido à sua biocompatibilidade, a transparência e a permeabilidade a gases 13. O PDMS é preparado e excluídos do SU8 microusinado 2075 14,15 estruturas por um PDMS líquido sobre um "mestre", como descrito anteriormente em Jackman et al-spin coating. 16 TEle alcançou modelado redes neuronais são compostos de módulos interligados de tamanho diferente e eles têm sido obtidos com êxito em ambas as lamelas e Microeletrodos Arrays (AMA) 17-20. A densidade das ligações entre os módulos podem alterar as características da rede de sincronização, a partir de uma rede totalmente sincronizados, típico das culturas uniformes, para estados transientes de sincronização entre os módulos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um protocolo para crescer redes neuronais modulares 2D in vitro composto por circuitos funcionalmente interligadas é descrito. O procedimento baseia-se moldando uma camada adesiva celular. A padronização é conseguido com PDMS stencils reproduzindo a característica negativa da arquitectura da rede desejada. Stencils PDMS definir as áreas onde a camada adesiva celular é depositada. Uma vez que as células são banhados, eles se reúnem espontaneamente para as ilhas revestidos e auto-organizar-se em circuit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo BRIANBOW Projeto Europeia (FP7 Jovens Exploradores, Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jacopo Tessadori para comentários úteis sobre o manuscrito, e Silvia Chiappalone por sua ajuda na produção dos gráficos usados no vídeo.
Materials
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |
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