Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.
Probe-gebaseerde kwantitatieve PCR (qPCR) een voorkeur werkwijze voor het meten transcript overvloed, omdat het een van de meest gevoelige detectiemethoden een nauwkeurige en reproduceerbare analyse levert. Probe-gebaseerde chemie biedt de minst achtergrond fluorescentie in vergelijking met andere (dye-based) chemie. Momenteel zijn er verschillende platforms die gebruik probe gebaseerde chemie transcript overvloed kwantificeren. qPCR in een plaat met 96 putjes is de meest gewoonlijk gebruikte methode is echter slechts maximaal 96 monsters of miRNAs kunnen worden getest in een enkele run. Dit is tijdrovend en vervelend als een groot aantal monsters / miRNAs worden geanalyseerd. High-throughput-probe gebaseerde platforms zoals microfluidics (bijv TaqMan Array Card) en nanofluidics arrays (bijv OpenArray) bieden hun gemak reproduceerbaar en efficiënt op te sporen de overvloed van meerdere microRNAs in een groot aantal monsters in een korte tijd. Hier tonen we de experimentele opstelling eennd protocol voor miRNA kwantificering van serum of plasma-EDTA monsters met probes gebaseerde chemie en drie verschillende platforms (96 putjes, microfluïdische en nanofluidics arrays) met toenemende doorvoer.
MicroRNAs (miRNAs) zijn ~ 22 nucleotide niet-coderende (nc) RNA's, functioneren als regulatoren van genexpressie 1-3. De meeste miRNAs bij dieren verricht door sequentiespecifieke baseparing met een mRNA, gericht op de 3'-UTR, hetgeen leidt tot negatieve regulatie van genexpressie 2-4. Dit gebeurt meestal via remming van mRNA translatie of door ribosomale drop-off. miRNAs in omloop is aangetoond om nieuwe biomarkers in onderzoek en klinische velden voor diverse ziekten zoals diabetes 5-7, ovariale 8, 9, prostaat- en borstkanker 10,11, hepatitis B-12 en andere auto-immuunziekten 13. Onderzoek is uitgevoerd overvloedige miRNAs identificeren in verschillende cellen of weefsels, en in omloop uit menselijk plasma en serum, die gemakkelijker en met minder invasieve 9,11-15.
Verschillende methoden van miRNA kwantificering hebben e geweestIngesteld met behulp van meerdere platforms, zoals de standaard 96-well plaat platform 4,12,16-18, de microfluidics kaart platform 12,18-23 en de nanofluidics testplatform 17,24. Kwantitatieve real time PCR (qPCR) biedt de mogelijkheid om relatieve of absolute aantal transcripten te meten met behulp van meerdere (dye of probes gebaseerde) chemie. Probe-based real-time PCR chemie biedt het voordeel van lage achtergrond fluorescentie en hoge gevoeligheid voor een enkel transcript kopie detecteert. Het is relatief kosteneffectief, eenvoudig te gebruiken en zeer reproduceerbaar, waardoor het een favoriete methode voor het kwantificeren en het bepalen van miRNA expressie 25. Probe-based qPCR methode houdt in het algemeen in twee stappen: reverse transcriptie (RT) en qPCR 4,26,27. RT is waar de stamlus RT-primer wordt gehybridiseerd met een rijpe of primaire miRNA molecuul en omgezet in complementaire (c) DNA. Kwantificering van het cDNA wordt vervolgens uitgevoerd met miRNA-specifieke PCR primers26-28. Het principe van probe-gebaseerde qPCR is gebaseerd op de detectie van complementaire streng verlenging in real time, waarbij hydrolyse van de fluorescent gemerkte probe omvat. Deze probes zijn ontworpen om een fluorescente reporter en een quencher die net elkaar om FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kunnen worden onderzocht. Detectie van de emissie van de fluorescentie rapporteur (zender) wordt gemaskeerd door de nabijheid van de quencher molecule. Wanneer Taq polymerase (pol) zich vanaf de stroomopwaartse primer en een vork (einde van de sonde de 5 ') bereikt, het Taq pol exonuclease activiteit hydrolyseert de sonde, waardoor de fysische dissociatie / scheiding van de fluorescente emitter van de quencher. Deze release van een enkel molecuul van fluorescentie zender wordt opgenomen door de detector en gepresenteerd als een incrementele toename van de fluorescentie signaal van die goed / reactie. De toename in fluorescentie is evenredig met de hoeveelheid PCR product gegenereerd, waardoor een nauwkeurige quantification van de geamplificeerde doel 26,28.
Met de toenemende vraag in miRNA kwantificering zijn gemiddelde tot hoge doorvoer technologieën ontwikkeld om een groter aantal monsters in een korte tijd te verwerken. TaqMan Low Density Array (TLDA) is een middelgrote doorvoer innovatief microfluïdische ontwerp op probes gebaseerde qPCR chemie met een toename van het aantal miRNAs op een plaat geanalyseerd. TLDA omvatten het gebruik van een vooraf bepaalde pool van RT-primers die worden gebruikt voor het synthetiseren van het cDNA. Deze cDNA's worden vervolgens gesponnen tot een aangepaste 384 goed micro-fluïde kaart om de expressie van meerdere miRNAs gebruik qPCR 22,26,29 bepalen. Elk putje van de kaart bevat gedroogde primers en probes specifieke miRNA (s) versterken, dus tot 384 reacties kunnen in één TLDA kaart 26 verwerkt.
De nanofluidics array is een high-throughput platform dat wordt gebruikt voor detectie van gen transcripten <sup> 24 gebruikmaking van dezelfde probes gebaseerde chemie. Het maakt gebruik van een eigen matrix met hydrofobe-hydrofiele interacties eenvoudig laden van de 33 nanoliter reactiemengsel in een array van 3072 doorgaande gaten op een roestvrij stalen glijbaan 24 te vergemakkelijken. Dit artikel richt zich op het aantonen hoe deze werkwijzen voor het kwantificeren van miRNAs in serum / plasma wordt uitgevoerd en de kritische factoren die moeten worden overwogen bij het uitvoeren en interpretatie van dergelijke gegevens. Genomen om rekening te houden, zullen hun individuele voordelen en beperkingen in dit artikel worden besproken.
De kritische stappen in de probes gebaseerde qPCR protocollen om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te verkrijgen om er zeker 1) dezelfde hoeveelheid en concentratie van RT-product wordt in elke qPCR reactie geladen, 2) de juiste verhoudingen en hoeveelheden van de componenten die nodig zijn voor qPCR reactie worden voorbereid en goed gemengd, 3) de correcte en consistente volumes worden toegevoegd aan elke qPCR reactie, en 4) de voorbereiding en het laden van elk monster en het reactiemengsel wordt voltooid in de kortst mogelijke tijd, terwijl nog steeds bewust van de bovenstaande kritische stappen eerder vermeld.
De microfluidics reeks kaarten nodig geschikte centrifuge en specifieke emmers. Elke emmer kan maximaal 3 kaarten (geladen / leeg). Zorg er altijd voor dat alle 3 slots van een emmer bezet zijn en de emmer wordt in evenwicht gehouden door het plaatsen van vergelijkbare emmer (deze bak moet ook 3 kaarten, leeg of vol bevatten) in de tegenovergestelde sleuf van de centrifuge. Terwijl het plaatsen van de kaart in de bucket houder, zorg ervoor dat de 8 reservoirs projecteren naar boven en reactieputjes geconfronteerd met de buitenwand van centrifuge. Spin kaarten bij 331 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Na de eerste spin, opent u de centrifuge en visueel zorgen de reactie mix is afgegeven door de 384 putten. Herhaal de spin in dezelfde instellingen voor nog 1 keer. Neem de kaart uit emmer en zorgen dat het niveau van reactiemengsel in elk van de reservoirs 8 is uniform. Inconsistenties in de vloeistofvolumes links in de reservoirs maakt de kaart ongeschikt verdere gebruik.
Om dezelfde concentratie van het RT-product, wordt dezelfde ingang concentratie van RNA toegevoegd in elke RT-reactie. Het totale RNA-concentratie wordt gemeten met een micro-volumespectrophotometer. De waargenomen 260/280 verhouding kan zo laag als 1.3 voor de RNA geïsoleerd uit plasma / serum zijn; dit lijkt geen effect te hebben op downstream-qPCR gerelateerde verwerking of gegenereerd 30. Ook de verhouding 260/280de RNA monsters hierin geteste tussen 1,3-1,7 geen abnormale effecten in het qPCR waargenomen.
Bij gebruik van laag gehalte RNA monsters, zoals die van biovloeistoffen, kan het moeilijk zijn om RNA voorafgaand aan de verwerking kwantificeren. Wij raden het gebruik van synthetische spike-in in het RNA-isolatie, evenals het omgekeerde fasen transcriptie. In onze ervaring, Arabidopsis thaliana miRNA kandidaten (ATH-miR-159a en ath-miR-172a) de voorkeur boven Caenorhabditis elegans miRNAs (zoals CEL-miR-39 of CEL-miR-54), die in onze ervaring hoger kunnen hebben homologie dan die van A. thaliana. Het gebruik van dergelijke fasespecifieke spike-in kan verklaren de normalisatie van miRNA data over meerdere monsters geanalyseerd op verschillende tijdstippen. Met behulp van een vaste ingang volume van RNA voor cDNA-synthese reactie wordt ook aanbevolen 32,33.
De drie probes gebaseerde protocollen voor miRNA kwantificering hier beschreven vereisen verschillende hoeveelhedentotaal RNA-ingang, verschillende workflows en kosten. Elk van de workflows zijn ontworpen om te voorzien in verschillende doorvoersnelheden op basis van het aantal miRNA targets en het aantal te analyseren monsters. Met toenemende doorvoer (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), de kosten per reactie afneemt met een toename in de hoeveelheid gegevens verkregen over een tijdseenheid. Omdat al deze platforms gebruiken TaqMan chemie kan worden verwacht de kwaliteit van de gegevens verkregen vergelijkbaar. TaqMan qPCR is een bekende methode voor het identificeren van de overvloed van miRNAs in serum / plasma monsters 9,11,27. Hoewel de drie platforms besproken dezelfde chemie, een afname van het reactievolume leidt tot een afname van het dynamisch bereik van transcript detectie (Farr RJ et al., Ongepubliceerde gegevens). De 96-well qPCR platform is een lagere doorvoersnelheid, maar hoge gevoeligheid platform en in onze ogen, de "gouden standaard" voor alle probes gebaseerde (of kleurstoffen gebaseerde) PCR-platforms. Dit kan echterde meest economische of efficiënt platform niet zijn als enkele honderden of duizenden monsters worden geanalyseerd en voor meerdere microRNAs. Microfluidics (TLDA) en nanofluidics (OA) platforms zijn high-throughput / content platforms ontworpen om acquisitie van grotere gegevens mogelijk te maken in een kortere tijd. Hoewel batch verschillen waargenomen in de TLDA kaarten, kan deze worden geminimaliseerd door het vragen TLDA kaarten van dezelfde partij. We merken op dat TLDA platform (figuur 3) toonde significante verschillen in 17% van mid – lage abundantie miRNAs bij testen met dezelfde monster op verschillende partijen TLDA kaarten. Daarom adviseren wij het gebruik van de dezelfde partij nummers voor analyse met behulp van TLDA kaarten. Deze variatie kan ook worden veroorzaakt door de technische variabiliteit inclusief mogelijke laad- en pipetteringsfouten. Echter, raden wij bestellen / aanvragen van dezelfde partij TLDA kaarten. Geen significante batch variatie werd waargenomen op de OA platform. Ondanks dit, TaqMan gebaseerd ExperimenTal qPCR benadert aanbod gemak naar de overvloed van miRNAs in plasma / serum monsters te meten. De lage, middelhoge en hoge throughput benaderingen hier besproken bieden de flexibiliteit om een reeks van samples en miRNAs met behulp van een zeer efficiënte, reproduceerbare en schone (lage ruis) chemie analyseren.
The authors have nothing to disclose.
Alle auteurs erkennen de ondersteunende infrastructuur van de NHMRC CTC, Universiteit van Sydney, de Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australië en de Rebecca Cooper Foundation, Australië. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de Australian Research Council (FT110100254) en de JDRF, Australië (CRN201314) naar WW, RJF AAH en MvJ uitgevoerd helemaal nat lab experimenten, ASJ uitgevoerd data-analyse. WW schreef het eerste ontwerp. AAH gepland de studie en de gegevens geanalyseerd. Alle auteurs gelezen en akkoord over de definitieve versie van het manuscript, cijfers en werkbladen voor publicatie voorgelegd.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |