MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti.
Base-Probe PCR quantitativa (qPCR) è un metodo preferito per misurare trascrizione abbondanza, poiché è uno dei metodi di rilevamento più sensibili che fornisce un'analisi accurata e riproducibile. Chimica a base-Probe offre lo sfondo minimo di fluorescenza rispetto ad altri (di tipo dye) chimiche. Attualmente, ci sono diverse piattaforme disponibili che la chimica a base di probe uso per quantificare trascrizione abbondanza. qPCR in una piastra ben 96 è il metodo più utilizzato di routine, ma solo un massimo di 96 campioni o miRNA può essere testato in un unico passaggio. Questo richiede tempo e noioso se un gran numero di campioni / miRNA sono da analizzare. High-throughput piattaforme sonda-based come microfluidica (es TaqMan carte Array) e gli array nanofluidica (es OpenArray) offrono facilità per rilevare riproducibile ed efficiente l'abbondanza di più microRNA in un gran numero di campioni in breve tempo. Qui, dimostriamo il setup sperimentalend protocollo per miRNA quantificazione da siero o campioni di plasma EDTA, utilizzando la chimica probe-based e tre piattaforme differenti (96 pozzetti, microfluidica e array nanofluidica) offrono livelli crescenti di throughput.
I microRNA (miRNA) sono ~ 22 nucleotidi non codificanti (nc) RNA, funzionante come regolatori dell'espressione genica 1-3. La maggior parte dei miRNA negli animali funzionano attraverso specifiche-sequenza di basi accoppiamento con un mRNA, targeting 3 'UTR, che porta a regolazione negativa dell'espressione genica 2-4. Questo di solito avviene attraverso l'inibizione della traduzione mRNA o ribosomiale drop-off. miRNA in circolazione hanno dimostrato di essere nuovi biomarcatori nella ricerca e campo clinico per una varietà di malattie, come il diabete 5-7, ovaie 8, 9 prostata e della mammella 10,11, l'epatite B 12 e di altre malattie autoimmuni 13. La ricerca è stata condotta per identificare miRNA abbondanti in cellule o tessuti differenti, così come in circolazione dal plasma umano e campioni di siero, che è più accessibile e meno invasivo 9,11-15.
Diversi metodi di quantificazione miRNA sono stati estituito utilizzando più piattaforme, come ad esempio la piattaforma piastra standard 96 pozzetti 4,12,16-18, la piattaforma di carta microfluidica 12,18-23 e la piattaforma nanofluidica matrice 17,24. Quantitativa real-time PCR (qPCR) offre la possibilità di misurare i numeri relativi o assoluti di trascrizioni con multipla (di coloranti o sonda-based) chimiche. Base-Probe real-time PCR chimica offre il vantaggio di sfondo bassa fluorescenza e alta sensibilità per rilevare una singola copia trascrizione. E 'relativamente conveniente, semplice da usare e altamente riproducibile, che lo rende un metodo preferito per quantificare e determinare miRNA 25. Metodo qPCR base-Probe prevede generalmente due fasi: trascrizione inversa (RT) e qPCR 4,26,27. RT è dove il primer stem-loop RT è ibridato ad una molecola di miRNA maturo o primario e convertito complementare (c) del DNA. La quantificazione del prodotto cDNA viene quindi effettuata utilizzando miRNA-specifici primer PCR26-28. Il principio di base di sonda qPCR è basato sul rilevamento di estensione filamento complementare in tempo reale, che comporta l'idrolisi della sonda fluorescente-tag. Queste sonde sono progettate per contenere un reporter fluorescente e un quencher che sono solo parte per consentire FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Rilevamento delle emissioni dal giornalista di fluorescenza (emettitore) è mascherato dalla vicinanza della molecola quencher. Quando Taq polimerasi (pol) si estende dal primer monte e raggiunge una forcella (estremità 5 'della sonda), la Taq attività esonucleasi pol idrolizza la sonda, portando ad una fisica di dissociazione / separazione dell'emettitore fluorescente dal quencher. Questa versione di una singola molecola di fluorescenza emettitore è registrato dal rivelatore e presentato come un aumento incrementale nel segnale di fluorescenza da tale bene / reazione. L'aumento della fluorescenza è proporzionale alla quantità di prodotto di PCR generato, permettendo una accurata quantification del 26,28 bersaglio amplificato.
Con l'aumento della domanda in miRNA quantificazione, medio tecnologie high-throughput sono stati sviluppati per consentire a un maggior numero di campioni da elaborare in un breve lasso di tempo. TaqMan Low Density Array (TLDA) è un mezzo throughput microfluidica disegno innovativo basato su sonda basata qPCR chimica offrendo un aumento del numero di miRNA analizzati su una piastra. TLDA comporta l'uso di una piscina predefinito di RT-primers utilizzati per sintetizzare il cDNA. Questi cDNA vengono poi filata in una misura 384 carta e micro-fluidico per determinare l'espressione di più miRNA utilizzando qPCR 22,26,29. Ogni pozzetto della card contiene asciugato primer e sonde per amplificare specifici miRNA (s), quindi fino a 384 reazioni possono essere trasformati in carta singola TLDA 26.
L'array nanofluidics è una piattaforma ad alta produttività che viene utilizzato per il rilevamento di trascritti genici <sup> 24 utilizzando la stessa chimica probe-based. Si utilizza una matrice proprietaria offre interazioni idrofobiche-idrofilo per facilitare il caricamento della miscela di reazione 33 nanolitri in una matrice di 3072 fori passanti su uno scivolo 24 in acciaio inossidabile. Questo articolo si concentra su che dimostra come vengono eseguiti questi metodi per quantificare miRNA nel siero / plasma ed i fattori critici che devono essere considerati quando si esegue e interpretare tali dati. Preso di conto, i loro benefici individuali e limitazioni saranno discussi in questo articolo.
Le fasi critiche all'interno dei protocolli qPCR sonda-based per ottenere risultati accurati e riproducibili sono per assicurarsi che 1) lo stesso volume e la concentrazione di RT-prodotto viene caricato in ogni reazione qPCR, 2) i rapporti ei volumi corretti dei componenti necessari per reazione qPCR sono preparati e ben mescolato, 3) i volumi corretti e coerenti vengono aggiunti ogni reazione qPCR, e 4) la preparazione e caricamento di ogni campione e reazione mix è completato nel più breve lasso di tempo possibile, mentre ancora memore di i punti critici di cui sopra in precedenza.
Le schede matrice microfluidica bisogno adatto centrifuga e secchi specifici. Ogni secchio può contenere fino a 3 schede (caricato / vuoto). Verificare sempre che tutti e 3 gli slot di un secchio sono occupati e il secchio è bilanciato mettendo bucket simile (questo secchio dovrebbe contenere anche 3 carte, vuote o piene) nella fessura opposta della centrifuga. Pur ponendo la scheda nel buckeSupporto t, accertarsi che le 8 serbatoi proiettano verso l'alto e pozzetti di reazione di fronte la parete esterna di centrifuga. Spin carte a 331 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. Dopo il primo giro, aprire la centrifuga e verificare visivamente la miscela di reazione è stato erogato attraverso i 384 pozzi. Ripetere il lancio a stesse impostazioni per 1 più tempo. Rimuovere la carta dal secchio e garantire che il livello della miscela di reazione in ciascuna delle 8 serbatoi è uniforme. Eventuali incoerenze nei volumi di liquido lasciato nei serbatoi rendono la scheda inappropriato utilizzare ulteriormente.
Per avere la stessa concentrazione del RT-prodotto, stessa concentrazione di ingresso di RNA viene aggiunto in ciascuna reazione RT. La concentrazione di RNA totale viene misurata usando un micro-volumespectrophotometer. Il 260/280 rapporto osservato può essere a partire da 1.3 per l'RNA isolato da plasma / siero; questo non sembra avere un effetto sul downstream processo qPCR correlati o dati generati 30. Analogamente, il rapporto di 260/280i campioni di RNA qui testati sono stati tra 1,3-1,7 senza effetti anomali nel qPCR osservati.
Quando si utilizzano campioni a basso contenuto di RNA, come quelli di biofluidi, può essere difficile quantificare RNA prima dell'elaborazione. Si consiglia l'uso del sintetico spike-in presso l'isolamento di RNA e le fasi di trascrizione inversa. Nella nostra esperienza, i candidati Arabidopsis thaliana miRNA (ATH-miR-159A e ath-miR-172 bis) è preferito su Caenorhabditis elegans miRNA (come CEL-miR-39 o cel-miR-54), che nella nostra esperienza può avere maggiore omologia di quelli A. thaliana. L'uso di tale picco-in specifici per fase può spiegare la normalizzazione dei dati miRNA su più campioni analizzati in tempi diversi. Utilizzando un volume d'ingresso fisso di RNA per reazione di sintesi cDNA è anche raccomandato 32,33.
I tre protocolli sonda-based per miRNA quantificazione descritte richiedono quantità variabilidell'ingresso RNA totale, diversi flussi di lavoro e costi. Ciascuno dei flussi di lavoro sono progettati per soddisfare diverse throughput in base al numero di bersagli miRNA e il numero di campioni da analizzare. Con l'aumento della velocità (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), il costo per reazione diminuisce con un aumento della quantità di dati ottenuti in una unità di tempo. Poiché tutte queste piattaforme TaqMan utilizzano la chimica, la qualità dei dati ottenuti si può aspettare che sia simile. TaqMan qPCR è un metodo consolidato per identificare l'abbondanza di miRNA in campioni di siero / plasma 9,11,27. Anche se i tre piattaforme discussi qui condividono la stessa chimica, una diminuzione del volume di reazione porta ad una diminuzione della gamma dinamica di rilevamento trascrizione (Farr RJ et al., Dati non pubblicati). La piattaforma qPCR 96-bene è un rendimento più basso, ma la piattaforma alta sensibilità e, a nostro avviso, il "gold standard" per tutti i probe-based (o la tintura a base) piattaforme PCR. Tuttavia, questo puònon essere la piattaforma più economico o efficiente se diverse centinaia o migliaia di campioni vengono analizzati e per più microRNA. Microfluidics (TLDA) e nanofluidica piattaforme (OA) sono piattaforme high-throughput / contenuti progettate per consentire l'acquisizione di dati più grandi in un tempo più breve. Anche se le differenze lotti sono state osservate nelle carte TLDA, questo può essere minimizzato richiedendo carte TLDA dallo stesso lotto. Osserviamo che la piattaforma TLDA (Figura 3) ha mostrato variazioni significative nel 17% dei media – miRNA bassa abbondanza durante il test con lo stesso campione in diversi lotti di carte TLDA. Si consiglia pertanto di utilizzare gli stessi numeri di lotto per l'analisi utilizzando carte TLDA. Questa variazione potrebbe anche essere dovuto alla variabilità tecnica, comprese eventuali potenziali errori di caricamento e di pipettamento. Tuttavia, si consiglia di ordinazione / richiesta dello stesso lotto di carte TLDA. Nessuna variazione lotto significativo è stato osservato sulla piattaforma OA. Nonostante questo, TaqMan speri baseTal qPCR avvicina offerta facilità di misurare l'abbondanza di miRNA in campioni di plasma / siero. Gli approcci di throughput a bassa, media e alta discussi qui offrono la flessibilità necessaria per analizzare una serie di campioni e miRNA con un (a basso rumore di fondo) chimica altamente efficiente, riproducibile e pulita.
The authors have nothing to disclose.
Tutti gli autori riconoscono il supporto infrastrutturale del NHMRC CTC, Università di Sydney, la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), l'Australia e la Cooper Fondazione Rebecca, Australia. Questa ricerca è stata finanziata attraverso sovvenzioni dal Consiglio australiano Research (FT110100254) e la JDRF, Australia (CRN201314) per AAH WW, RJF e MVJ effettuato tutto bagnato laboratorio di sperimentazione, ASJ effettuata l'analisi dei dati. WW ha scritto la prima bozza. AAH pianificato lo studio e analizzato i dati. Tutti gli autori hanno letto e hanno concordato la versione finale del manoscritto, figure e fogli di lavoro presentati per la pubblicazione.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |