モデルマメに初期胚発生の調節を研究するための接合体と体細胞胚を得るためのプロトコル<em>のMedicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
単一細胞受精卵から始まる初期胚は、急速な細胞分裂や形態形成を通過し、形態学的に前球状、球状、心臓、魚雷と子葉の段階によって特徴づけられます。この進歩的な開発は複雑な分子ネットワークの厳しい規制下にあります。開発の同様の段階で十分な初期胚を収穫することは初期胚の細胞および分子の規制を調査するために不可欠です。 Medicagoにするための、例えば 8日早い子葉段階に到達するためにtruncatulaながら初期胚発生が短い急速な形態形成を受けるので、これは簡単ではありません。ここでは、二つのアプローチによって問題を解決します。最初のものは、接合胚の段階を示すうえで胚発生とポッドの形態との間の結合を確立します。これは、特にポッドスパイラルと棘の開発の数に基づいています。 in vivoでのを補完する別の方法tudiesは体細胞胚を生産するために培養葉の外植片を介してです。オーキシン（1-ナフタレン酢酸）、サイトカイニン（6-ベンジルアミノプリン）、アブシジン酸およびジベレリン酸 – 媒体は珍しいホルモンの組み合わせを含みます。異なる段階は、解剖せずに、カルスから成長している識別することができます。
Introduction
収穫面積と総生産1で穀物に2つ目の豆類は、約20,000種およびマメ科（またはマメ科）家族と高等植物の第三位のファミリーです。大豆は第三位の栽培作物です。穀物豆類は、人間の消費の2のための食事性タンパク質と植物油の三分の一の約3分の1を提供します。それらのN 2の固定容量のマメ科植物はまた、持続可能な農業システムに貢献しています。 のMedicago truncatula、大豆のように、その種子の子葉にタンパク質と油を格納し、かなりの遺伝的およびゲノム資源3,4との遺伝的およびゲノムマメ科モデルです。 M.一方、 truncatulaは 、それがますますマメ科植物の種子生物学5-7と胚8,9を研究するために採用されているマメ科植物根粒共生4の理解の進歩を可能にしました。シロイヌナズナの胚発生は広範囲に私は10,11を研究し、それされていますSA非マメ及び胚発生の詳細はMedicagoに8,10と同じではありません。 Mの接合体胚発生truncatulaは 独特の多下垂、endoployploid懸垂帯および基底転送セル8と、興味深い機能を備えています。
体細胞胚形成（SE）は、一般的に、植物12を再生するために使用されます。マメ科モデルMのtruncatulaは 、シードラインJemalong 2HA（2HA）は体細胞胚形成13率の高さを持っている親Jemalongから開発されてきました。生産胚の数は、最近確立された実質的に長い媒体14にジベレリン酸（GA）およびアブシジン酸（ABA）の両方を添加することによって増加しています。 GAとABAは通常拮抗14を作用することが与えられた珍しい相乗的にこの場合はGAとABAの作用します。カルスから生産胚は、胚発生の段階が容易にvisuallを決定することができる表面上で開発しますY、容易に回収しました。胚形成（2HA）と非胚形成されている同質遺伝子系統（Jemalong）の近くに持つことは、体細胞胚形成の調査を容易にし、 インビボおよびインビトロ系の両方持つことは、種々の実験の可能性を提供します。
胚発生の細胞および分子メカニズムを理解することは、種子及び植物の開発を理解するために不可欠です。マメ科植物では、他の双子葉植物のように、それは、ヒトの栄養のために使用される製品を保存胚の子葉です。初期胚は、急速な細胞分裂、正しい胚のパターン形成を伴います。受精後約8日、Mのtruncatula胚は、初期の子葉段階に達します。形態学的特徴を正確に温室条件下で受精後日数で示されていません。このように、発生中の胚の段階を示すために、効率的な標準化されたアプローチは、遺伝的regulの研究に貴重なものです初期の接合体胚のエーション。
本稿では、マメ科植物のモデルMに胚発生の生物学的研究のために開発した胚を収集するために、2つの標準化されたプロトコルを提供しますtruncatula。第1は、第二は、簡単にアクセス大きな胚番号を提供するために、培養葉移植片を介して、体細胞胚形成の間、胚発生およびポッド形態を関連付けることにより、接合胚を収集することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されているプロトコルは比較的単純であり、すべての現代的な細胞および分子技術とマメ科植物の胚発生の調査を可能にします。我々は両方の利点と欠点は、インビボおよびインビトロの方法であることを認識しています。両方とも、未熟種子19の培養に比べて初期胚発生に関する詳細フォーカスを可能にします。
in vivo試験の場?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
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