Protocolos para obtenção de embriões somáticos e Zygotic para estudar a regulação do desenvolvimento embrionário precoce no Modelo de leguminosas<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
No início da embriogênese a partir de uma única célula zigoto passa por rápida divisão celular e morfogênese, e é caracterizada morfologicamente por estágios de pré-globular, globulares, coração, torpedo e cotilédones. Esta evolução progressiva está sob a regulação apertada de uma rede molecular complexa. Colhendo embriões suficientes em um estágio similar de desenvolvimento é essencial para a investigação da regulação celular e molecular da embriogênese precoce. Isso não é simples, uma vez embriogênese sofre morfogênese rápido em um curto espaço de tempo por exemplo, oito dias para Medicago truncatula para chegar à fase de cotilédones cedo. Aqui, nós resolver a questão através de duas abordagens. O primeiro estabelece uma ligação entre o desenvolvimento do embrião e morfologia pod em ajudar indicar a etapa do embrião zigótico. Isto é particularmente com base no número de espirais e desenvolvimento das espinhas pod. Uma forma alternativa para complementar o s in vivotudies é através de cultura de explantes de folhas para produzir embriões somáticos. O meio inclui uma combinação de hormônio incomum – uma auxina (ácido 1-naftalenoacético), uma citocinina (6-benzilaminopurina), ácido abscísico e giberelina. As diferentes fases pode ser discernido que cresce fora do calo sem dissecção.
Introduction
Legumes são a terceira maior família de plantas superiores com cerca de 20.000 espécies e da (ou Fabaceae) família Leguminosae são segundo para os cereais produzidos na área colhida e produção total de 1. A soja é a terceira maior safra cultivada. Leguminosas fornecer cerca de um terço da proteína da dieta e um terço de óleo vegetal para consumo humano 2. Legumes com a sua capacidade de fixação de N 2 também contribuir para sistemas agrícolas sustentáveis. Medicago truncatula, como soja, lojas de proteína e óleo nos cotilédones de suas sementes e é um modelo legume genética e genómica com consideráveis recursos genéticos e genômicos 3,4. Enquanto M. truncatula permitiu avanços na compreensão da simbiose rizóbio-leguminosa 4 tem sido cada vez mais utilizados para estudar biologia sementes de leguminosas 5-7 e embriogênese 8,9. Arabidopsis embriogénese tem sido extensivamente estudada 10,11 mas isa não leguminosa e os detalhes da embriogénese não são idênticos aos Medicago 8,10. Embriogênese Zygotic em M. truncatula tem características interessantes, com um hipófise multicelular distintivo, um suspensor endoployploid e célula de transferência basal 8.
Embriogênese somática (SE) é comumente usado para regeneração de plantas 12. No modelo de leguminosa M. truncatula, a linha de semente Jemalong 2HA (2HA) foi desenvolvido a partir do pai Jemalong a ter altas taxas de embriogênese somática 13. O número de embriões produzidos recentemente tem sido substancialmente aumentada pela adição tanto de ácido giberélico (GA) e ácido abscísico (ABA) para a forma longa estabelecida 14. Neste caso GA e agir sinergicamente ABA, o que é incomum, dado que GA e ABA normalmente agem antagonicamente 14. Os embriões produzidos a partir de calo desenvolver na superfície que permite que a fase de embriogénese a ser prontamente determinada Visually e facilmente colhidas. Tendo em perto de linhas isogénicas que são embriogénicos (2HA) e não embriogénico (Jemalong) facilita a investigação de embriogénese somática e tendo tanto in vivo como em sistemas in vitro proporciona diferentes possibilidades experimentais.
A compreensão dos mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento do embrião é essencial para a compreensão de sementes e o desenvolvimento da planta. Em leguminosas, como em outros dicotiledóneas, são os cotilédones do embrião que armazenar os produtos que são utilizados para a nutrição humana. Embriogênese inicial envolve a divisão celular rápida e padronização embrião correta. Em cerca de 8 dias após a fertilização, a M. truncatula embrião atinge estágios iniciais de cotilédones. A caracterização morfológica não é exatamente indicado por dias após a fertilização em condições de casa de vegetação. Assim, uma abordagem padronizada eficiente para indicar a fase de embriões em desenvolvimento é valioso no estudo da genética regulção da embriogênese zigótica cedo.
Neste artigo, nós fornecemos dois protocolos padronizados para coletar embriões em desenvolvimento para estudos biológicos da embriogênese no modelo legume M. truncatula. O primeiro deles é coletar embriões zigóticos, associando a embriogênese e pod morfologia enquanto o segundo é embriogênese somática via explantes foliares cultura para fornecer um grande número de embriões facilmente acessados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos descritos são relativamente simples e permitir a investigação de embriogênese legume com toda a célula contemporânea e técnicas moleculares. Reconhecemos que há vantagens e desvantagens de ambos in vivo e in vitro abordagens. Ambos permitem mais foco na embriogênese inicial em relação à cultura de sementes imaturas 19.
No caso de estudos in vivo que é descrito é predominantemente o isolamento do óvulo da vagem que é adequado para mui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
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