無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析
Summary
Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
Abstract
特異的なリガンドで刺激すると嗅細胞（OSN）の生理的反応を分析する嗅覚主導の行動とその変調の基礎を理解することが重要です。これらの符号化特性は、匂い分子と嗅覚受容体（OR）との間の最初の相互作用に大きく依存OSNsで表されます。表現または重要であるのアイデンティティ、特異性およびリガンドスペクトル。 ORのリガンドを発見する確率は非常に低い上皮内でランダムに選択されたOSNで表されます。この課題に対処するため、このプロトコルは、定義されたORのプロモーターの制御下で蛍光タンパク質GFPを発現する遺伝子タグ付きマウスを使用しています。 OSNsは、隣接するセルは、それらの成熟と機能に影響を与えると、鼻腔ライニングしっかりと組織化上皮に位置しています。ここでは、OSNs eの特性をそのまま嗅上皮を分離し、パッチクランプ記録を介して記録する方法を説明します定義された嗅覚受容体をxpressing。プロトコルは、隣接する組織の影響力を維持しながら一つはOSNの膜特性を特徴付けることができます。パッチクランプ結果の分析は、リガンド/ OR相互作用、伝達経路および薬理学、OSNs 'コードの特性と膜レベルでのそれらの変調の正確な定量化をもたらします。
Introduction
嗅細胞（OSN）は、嗅覚の最初のステップを表しています。げっ歯類で鼻腔を裏打ちする嗅上皮に位置し、彼らは脳にその軸索を介して送信される活動電位への臭気物質の化学情報を変換します。より良い嗅覚符号化メカニズムを理解するためには、OSNsの伝達及び膜特性を特徴付けることが必要です。最近まで、哺乳類OSNsの性質を特徴づけるために使用される技術のほとんどが解離OSNs 1-4で行いました。解離過程は、その環境からOSNsを解放するために、様々な機械的および化学的（ すなわち 、酵素）プロセスを使用しています。これらのプロセスは、記録のために利用可能な細胞の数が少ないを誘導します。この低い数字は、GFP標識細胞の場合にはより一層重要になることがあります。解離もsurvivを高めることができるOSNsと嗅上皮の他の細胞との間の局所細胞と細胞の相互作用を除去しますアルとOSNsのプロパティの調整。解離手順を回避するためには、無傷の製剤は、5開発しました。
各OSNは、大規模な多重遺伝子ファミリーの6から選択される一つの嗅覚受容体（OR）を発現します。マウスの主嗅上皮で発現〜千論理和があります。野生型動物で、または多数の、同一または非常に低い発現をOSNsを記録するための機会のために。これらの制限を克服するために、遺伝子標的化マウスが利用可能であるもので識別されたOR蛍光タンパク質で標識されている7-9表す全てOSNs。これらの標識されたOSNsは、前述の欠点を持つ解離準備7,10,11で機能解析を行うために使用されました。遺伝的に標識されたマウスからの無傷の上皮の準備5は、したがって、これらの問題を回避します。それはviの中に近い環境で正確に定義された論理和を表現OSNsの活動の監視を可能にしますできるだけVO。また、OSNsのパッチクランプ記録は、膜の特性、伝達経路の薬理学、リガンド/ OR相互作用の正確な分析を可能にします。すべてのこれらのトピックはほとんど細胞外記録を用いて分析することはできません。我々は、嗅覚受容体SR1とMOR23 12,13を表現OSNsの応答を監視するには、この技術を使用していました。技術の実現可能性は、ニューロン15,16を表現OSNs 14を発現しているMOR23上の他のグループだけでなく、上の他の論理和により確認されました。 OSNsの定義された集団の監視は17、付臭剤誘起塑性18、及び臭気コーディング15における嗅覚受容体の配列の変異の役割を老化、このような開発14のような多くの異なる状況での特性の分析につながることができます。このプロトコルは、このように、膜レベルで定義されたOSNsの機能的特性を監視するための強力なツールを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
正しく健全なOSNsの特性を監視するために、このプロトコルの能力は、製剤の品質に大きく依存します。したがって、解剖の手順は非常に重要です。最初に、解剖媒体の質（pHは、浸透圧）、酸素および温度（氷のように冷たいが、凍結していない）に注意を払うことが重要です。第二に、解剖ツールと上皮の操作は、損害を回避することができるように制限する必要があります。最後に、可?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
Materials
| heavy equipment | |||
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| recording electrodes /system | |||
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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