定位注入法を適用すると、動物の行動の遺伝的影響を研究するために、
Summary
cDNAを発現するレンチウイルスまたはshRNAの定位注射は、マウスの特定の脳領域における遺伝子発現を調節することができます。ここでは、そのようなオープンフィールド試験（OFT）および強制水泳試験（FST）のような行動のタスク、と定位注射を結合するためのプロトコルを提示します。
Abstract
定位注射は、マウスにおける標的脳領域に高力価のレンチウイルスを提供する有用な技術です。レンチウイルスは、脳組織への重大な損傷を与えることなく、比較的着目領域における遺伝子発現を過剰発現またはノックダウンすることができます。回復後、注射したマウスは、オープンフィールド試験（OFT）および強制水泳試験（FST）などの様々な行動タスクにテストすることができます。 OFTは、マウスは、新規オープンフィールドの中央に費やす時間の量を測定することにより、マウスにおける運動や気になる表現型を評価するために設計されています。もっと気になるのマウスは、対照と比較して、新規フィールドの中央で有意に少ない時間を過ごすことになります。 FSTは、水の入ったバケツの中に入れたときにマウスが不動費やす時間の量を定量することにより、抗うつ表現型を評価します。抗うつ表現型を有するマウスは、対照動物と比較し有意に少ない時間不動を過ごすことになります。このプロトコルの目的は、STERを使用することです遺伝的要因は、動物の行動を調節する方法を評価する行動試験と一緒にレンチウイルスのeotactic注入。
Introduction
それは、遺伝的に操作が容易であるため、マウスは広く神経生物学で使用されています。遺伝子ノックアウト技術は、研究者がそれぞれの遺伝的要因がマウスの行動を整形する方法を調査することができます。また、CRE-のloxPシステムは、異なる組織における遺伝子機能を研究する研究者を可能にする、マウスに特異的な遺伝子ノックアウトタイプ-組織および細胞のための貴重なツールを提供しています。1しかし、実際には、CREプロモーターの発現パターンを制御するのが困難です、これまでに多くの確立されたCREドライバは地域特異的発現を達成していない。2,3
あるいは、定位注射は、成体マウスの特定の脳領域を標的とする方法です。のcDNAまたはshRNAを発現する遺伝子操作されたウイルスを注入することにより、遺伝子発現の領域に特異的な変調を達成することができます。各マウスの脳の大きさは変化するが、特定の脳領域の位置は、定位COORDIを用いて決定することができます臀部は、マウス脳の頭蓋骨のランドマークから設定します。最も一般的に使用されるランドマークはブレグマ、ラムダ、および耳間のラインです。脳アトラスから得られた座標を使用して、各脳領域の4つの正確な位置は、前後（A / P）によって識別することができ、内側-外側（M / L）、および背腹（D / V）がから軸ブレグマ/耳のラインの交差点。典型的には、注射は、蛍光顕微鏡検査によって確認することができるように、赤色、または緑色蛍光タンパク質（RFP又はGFP）のいずれかでタグ付けされたマウスの脳に注入したウイルス。
マウスの行動評価は、精神疾患の基礎研究のために特に必要です。患者における精神障害の症状は、典型的には、異常行動を伴います。これらの人間の行動の一部は、進化的に保存され、直接マウスに模倣し、観察することができます。たとえば、うつ病の行動的絶望を測定することにより、マウスでモデル化することができます。 OFTうつ病を持つ人々彼らがこれまでに役立ちます何もしないかのようにアンは、最終的に自殺につながる可能性が症状を感じています。げっ歯類では、これは、水のプールに浮遊対水泳マウス（放棄とみなす）の時間を測定する、強制水泳試験（FST）を使用してモデル化することができます。このパラダイムは、抗うつ薬との表現型を救出することによって検証されている。抗うつを受けた7,8,9マウスは、未処理対照と比較して不動大幅に少ない時間を過ごすことになります。別の行動試験、オープンフィールド試験（OFT）は、マウスにおいて運動を評価するために設計されており、さらにマウスで気になる表現型を分析するために使用することができる。5,6-このテストは、それらが接近しているときに、マウスをより安全に感じることを前提としています新規オープンフィールド内の壁に。彼らは好奇心の強い動物であるように、野生型マウスは、最終的には、新しい環境を探索します。ただし、フィールドの中央に少ない時間を費やしては、マウスがイニシアを克服することができなくなりますように、マウスに不安を示していますLの恐怖が新しい環境によってもたらされます。マウスの不安は、オープンフィールドの中央で費やす時間の量により定量されるように、多くの精神障害に存在するヒトでの臨床不安、と比較することができます。
行動パラダイムと定位注射の組合せは、対象の脳の領域に特異的な遺伝子の発現を改変するための新規な方法です。マウスの行動に変調遺伝子発現の効果が決定され得ます。脳全体のノックアウトとは対照的に、この方法は、それが、特定の脳領域を標的として特に有用です。また、定位注射は、典型的には、成人、野生型マウスで行われ、従って、内因性遺伝子の発現は、発生段階を通じて維持されています。遺伝子は、開発の胚または出生後の段階での生存のために必要とされている場合、このメソッドは、交絡の影響を回避します。一つの主要な制限は、実験用マウスはthroug行く必要があるということですHマウスの頭蓋骨を持っている侵襲手術は、オープンされます。さらに、遺伝子変調度は、ウイルスの力価及び効率によって決定されます。ウイルスは、特別な機器を必要とする定位座標を使用して適切な領域に注入する必要があります。正しい注射部位の確認のみ死後に完成させることができます。
この方法は、以前に様々な神経疾患における特定の遺伝子の関与を試験するために使用されてきました。例えば、（ドーパミンを合成することを可能にする）Thの遺伝子を標的ウイルス媒介性RNAiは、黒質緻密部に注入し、そして運動行動分析を行った。10別の研究では、関連して、マウスの挙動を評価するために、レンチウイルス、サイレンシングDISC1の定位注射を使用しました統合失調症に。 DISC1のノックダウンは、新規性に応じて増加した運動につながった（類似統合失調症における陽性症状）、およびより大きな不動FST 11は、同様に、追加の研究は、5-HT 1Bの過剰発現は、OFTに増加した探索行動に、この方法を用いて、抗不安表現型と一致つながったことがわかった。12定位注射はCRE-loxP配列マウスで組換えを誘導するためにCREウイルスを提供することができます。この方法は、選択的扁桃体におけるY2受容体と分界条床核を削除するために使用されました。行動分析の際に、これらのマウスは、遺伝子は、中央扁桃体に削除された抗うつ表現型に見つけましたが、された遺伝子が基底外側扁桃体や分界条床核に削除された表現型がない。13このように、この技術を動物行動の遺伝的影響を研究するためのユニークなツールを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功定位注射は三つの要因に依存している：、生きているマウスを維持する座標の正しいゼロ点（ブレグマの交点と耳間のライン上の針の先端）を設定し、ゼロ点に右の深さを設定する（針の先端をちょうど）脳組織の外側に触れます。マウスの生存率は重要です。手術の生存は、マウスが適切に麻酔し、適切な鎮痛を受けていることを確認することによって支援することができます。疼痛?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
References
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