Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales

Summary

Inyección estereotáctica de lentivirus que expresan los ADNc o shRNAs pueden modular la expresión génica en áreas específicas del cerebro de los ratones. A continuación, presentamos un protocolo para combinar inyecciones estereotáxica con las tareas de comportamiento, como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST).

Abstract

Inyección estereotáctica es una técnica útil para entregar los lentivirus de alto título a áreas del cerebro específicas en ratones. Los lentivirus pueden o bien sobreexpresan o la expresión de genes caída en una región relativamente centrado sin daño significativo al tejido cerebral. Después de la recuperación, el ratón inyectado puede ser probado en diversas tareas de comportamiento tales como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST). El OFT está diseñado para evaluar la locomoción y el fenotipo de ansiedad en ratones mediante la medición de la cantidad de tiempo que un ratón pasa en el centro de un campo abierto novela. Un ratón más ansiosos pasará un tiempo significativamente menor en el centro del campo novela comparación con los controles. El FST evalúa el fenotipo anti-depresivo mediante la cuantificación de la cantidad de tiempo que los ratones pasan inmóvil cuando se coloca en un cubo de agua. Un ratón con un fenotipo anti-depresivo pasará significativamente menos inmóvil tiempo en comparación con los animales control. El objetivo de este protocolo es usar el sterinyección eotactic de un lentivirus, en relación con las pruebas de comportamiento para evaluar cómo los factores genéticos modular comportamientos animales.

Introduction

El ratón ha sido ampliamente utilizado en la neurobiología, porque es fácil de manipular genéticamente. Técnicas knockout de genes permiten a los investigadores para investigar cómo cada factor genético da forma a los comportamientos del ratón. Por otra parte, el sistema cre-loxP proporciona una valiosa herramienta para tejidos y tipo de células knockout de genes específicos en ratones, lo que permite a los investigadores estudiar la función de genes en diferentes tejidos. ¹ Sin embargo, en la práctica, los patrones de expresión de los promotores cre son difíciles de controlar , y hasta ahora muchos conductores cre establecidos no han logrado específica de la región de expresión. ^2,3

Alternativamente, inyección estereotáctica es un método que se dirige a regiones específicas del cerebro del ratón adulto. Mediante la inyección de virus manipulados genéticamente que expresan ADNc o shRNA, específica de la región de modulación de la expresión génica se puede lograr. Aunque el tamaño del cerebro de cada ratón varía, la localización de regiones específicas del cerebro se puede determinar usando coor estereotácticanates ajustar desde puntos de referencia en el cráneo del cerebro del ratón. Los puntos de referencia más utilizados son bregma, lambda, y la línea interaural. Usando coordenadas obtenidas de un atlas del cerebro, ⁴ la ubicación exacta de cada área del cerebro puede ser identificado por la antero-posterior (A / P), medial-lateral (M / L), y ventral-dorsal (D / V) de los ejes bregma / intersección línea interaural. Normalmente los virus se inyecta en el cerebro de ratones etiquetados, ya sea con la proteína fluorescente de color rojo o verde (RFP o GFP), por lo que las inyecciones pueden ser confirmados por microscopía fluorescente.

Evaluaciones de comportamiento de los ratones son especialmente necesarias para la investigación básica de los trastornos psiquiátricos. Los síntomas de los trastornos psiquiátricos en pacientes típicamente involucran comportamientos anormales. Algunos de estos comportamientos humanos son evolutivamente conservados y pueden ser imitado directamente observado en el ratón. Por ejemplo, la depresión puede ser modelado en el ratón mediante la medición de la desesperación conductual. Las personas con depresión oftes sentir como si nada lo hacen jamás ayudar, un síntoma que eventualmente puede conducir al suicidio. En los roedores, esto puede ser modelado utilizando la prueba forzada Swim (FST), que mide la cantidad de tiempo que un ratón nadando contra flotando en un charco de agua (vista como renunciar). Este paradigma se valida mediante el rescate del fenotipo con antidepresivos. ^7,8,9 Los ratones que han recibido antidepresivos pasará significativamente menos inmóvil tiempo en comparación con los controles no tratados. Otra prueba de comportamiento, la prueba de campo abierto (OFT) está diseñado para evaluar la locomoción en ratones, y, además, puede ser utilizado para analizar el fenotipo de ansiedad en ratones. ^5,6 Esta prueba se basa en la premisa de que los ratones se sienten más seguros cuando están cerca a la pared en un campo abierto novela. Ratones de tipo salvaje finalmente explorar la novela medio ambiente, ya que son animales curiosos. Sin embargo, gastar menos tiempo en el centro del campo indica la ansiedad en el ratón, como el ratón no será capaz de superar la initial miedo provocado por un nuevo entorno. La ansiedad del ratón, tal como se cuantifica por la cantidad de tiempo gastado en el centro de un campo abierto, se puede comparar a la ansiedad clínica en humanos, que está presente en muchos trastornos psiquiátricos.

La combinación de inyecciones estereotáxicas con paradigmas de comportamiento es una nueva manera de alterar la expresión de un gen específico en un área del cerebro específica. El efecto de la expresión génica modulada en los comportamientos del ratón se puede determinar. En contraste con knockout de todo el cerebro, este método es particularmente útil, ya que sólo se dirige a áreas específicas del cerebro. Además, las inyecciones estereotáxicas se realizan típicamente en el adulto tipo salvaje del ratón, por lo tanto, la expresión del gen endógeno se ha mantenido a lo largo de las etapas de desarrollo. Este método evitará el efecto confundir si se requiere el gen para la supervivencia durante la etapa embrionaria o postnatal de desarrollo. Una limitación importante es que los ratones experimentales necesitan ir through una cirugía invasiva, en la que los cráneos de ratones tienen que abrirse. Por otra parte, el grado de modulación gen se determina por el título y la eficiencia del virus. El virus necesita para ser inyectada en la región correcta usando coordenadas estereotácticas, que requiere instrumentos especiales. Verificación del sitio de inyección correcta sólo se puede completar post mortem.

Este método ha sido utilizado previamente para probar la implicación de un gen específico en diversas enfermedades neurológicas. Por ejemplo, viral RNAi mediada por la orientación del gen Th (que permite la dopamina a ser sintetizado) se inyectó en la sustancia negra compacta, y se llevó a cabo el análisis del comportamiento locomotor. ¹⁰ Otro estudio utilizó inyección estereotáctica de un DISC1 silenciamiento lentivirus para evaluar el comportamiento del ratón en relación a la esquizofrenia. Derribo de DISC1 llevó a un aumento de la locomoción en respuesta a la novedad (paralelismos síntomas positivos en la esquizofrenia), y una mayor inmovilidad en elFST. ¹¹ De manera similar, un estudio adicional encontró que 5-HT _1B sobreexpresión condujo a un aumento de comportamiento exploratorio en el OFT, consistente con un fenotipo anti-ansiedad usando este método. ¹² inyecciones estereotácticos pueden entregar virus para inducir recombinación cre en ratones cre-loxP . Este método se utiliza para eliminar selectivamente el receptor Y2 en la amígdala y el núcleo lecho de la estría terminal. Tras el análisis del comportamiento, estos ratones se encontraron a un fenotipo anti-depresivo cuando el gen fue suprimido en la amígdala central, pero sin fenotipo cuando el gen fue suprimido en la amígdala basolateral o la cama núcleo de la estría terminal. ¹³ Por lo tanto, esta técnica proporciona una herramienta única para estudiar el efecto genético sobre los comportamientos de los animales.

Protocol

NOTA: Todos los protocolos con animales fueron seguidos de acuerdo con las directrices de cuidado de animales de la Universidad Estatal de Pennsylvania, IACUC # 44057

1. Lentivirus Producción

NOTA: El día antes de la transfección, las células LentiX-293 debe ser de al 80% de confluencia.

1. Enjuagar las células con DMEM justo antes de la transfección y se incuban en 10 ml de DMEM / FBS al 10% con penicilina (100 UI / ml) y estreptomicina (100 g / ml) durante 5 min a RT.
2. Diluir ADN y polietilenimina (PEI) (1 mg / ml) en relación 1: 3 (1 g de ADN: 3 l de PEI) en 1 ml de DMEM y agitar durante 1 min. El volumen de ADN añadido es dependiente de la concentración del ADN. Incubar a TA durante 10 min.
   1. Por ejemplo, utilizar 20 g de ADN plásmido, compuesto por 10 g de plásmido vector, 5 g de psPax2 ¹⁴ plásmido, 5 g de virus de la estomatitis vesicular (VSV) con 60 l de PEI por plato.
3. Añadir 1 / 10a volumen de medio de cultivo total de DMEM (es decir, 1 ml de medio de cultivo 10 ml en una placa de 100 mm). Añadir 1 ml de DNA-PEI gota a gota la mezcla en el plato y girar el plato alrededor hasta al medio de cultivo es bien mezclado con el ADN.
4. Incubar durante 6 hr a RT y eliminar el sobrenadante. Añadir 5 ml de medio de cultivo.
5. 48 h después de la transfección, recoger el líquido sobrenadante viral y centrifugado a 627 xg durante 5 min a 4 ° C en un tubo de 50 ml. Filtra 30 ml de sobrenadante viral a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras en un tubo de ultracentrífuga.
6. Añadir agua estéril para equilibrar los tubos, y cubrir los tubos con pequeño trozo de parafina. Tubos giran a 11.249 xg durante 120 min a 4 ° C. Retire el líquido usando una punta de vacío.
7. Añadir 100 l de PBS frío del tubo. Agite suavemente el tubo a 4 ° CO / N.
8. Para volver a suspender el virus, la pipeta tse añadió PBS en el paso 1.8 en los pellets de 10 veces, con cuidado de no tocar el pellet con la punta. El pellet no se volvió a suspenderse hasta que haya terminado.
9. Alícuota el virus a 10-20 l por tubo, flash-congelación en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.

2. La inyección estereotáctica

2.1) Preparación de Instrumentos

1. Coloque un par de tijeras, fórceps-extremos romos, un soporte de aguja, bisturí, hisopos de algodón, y un paño en un paquete sellado con un indicador de esterilización, y autoclave antes de la cirugía. Además, obtener 10% de yodo povidona, 70% de alcohol etílico, suturas absorbibles, una almohadilla eléctrica, lágrimas artificiales, un cordón esterilizador de vidrio, taladro, una broca, 2 jeringas desechables, una jeringa de inyección, máquina de afeitar eléctrica, analgésico (ketoprofeno), anestesia (Avertin), guantes, y un aparato estereotáctico con la bomba de inyección.
2. Hacer solución 1.25% avertin fresco ese día, el filtro en una campana estéril usando un 0,2 y# 181; m filtro de jeringa estéril, y colóquelo en un vial de suero estéril. Mezclar 2,5 g de alcohol 2,2,2-tribromoetilo en 5 ml de alcohol terc-amilo, luego se disuelven en 200 ml de agua. Mantener el pH por debajo de 5. ¹⁵

2.2) Preparación del ratón

1. Administrar avertin basado en el peso del ratón (375 mg / kg). ¹⁵ Inyectar el ratón con el avertin a través de una inyección intraperitoneal (IP) y, a continuación, coloque de nuevo en su jaula hasta que esté totalmente anestesiado.
2. Dale un analgésico a través de inyección IP (ketaprofen, 5 mg / kg), y el lugar de lágrimas artificiales en los ojos del ratón para evitar que se seque.
3. Asegúrese de que el ratón es completamente dormido pellizcando su pie. Si el ratón responde a la pizca pie, a continuación, dar más anestésico (en dosis de 50 l). Afeitarse la cabeza del ratón usando una máquina de afeitar eléctrica. Afeitarse el área a ser operado (típicamente desde justo detrás de las orejas, en la parte superior del hocico), y sus alrededores.
4. Coloque el puntero del ratón into del aparato estereotáxica. Cierre los dientes frontales en la abrazadera anterior, y baje la abrazadera y apriete para que la mandíbula es totalmente seguro.
5. Inserte las barras de oído en el canal auditivo para estabilizar por completo la cabeza. Tenga cuidado de no insertar las barras de oído en demasiado, lo que podría dañar el oído interno. Una vez terminado, el cuerpo del ratón debe ser capaz de ser movido ligeramente sin alterar la posición de la cabeza.
6. Coloque una almohadilla de calefacción bajo el ratón para regular la temperatura corporal del ratón durante todo el procedimiento.
7. Limpie el área quirúrgica a fondo. El uso de un hisopo de algodón, frotar 10% de povidona yodada en un movimiento circular, comenzando desde el centro de la zona quirúrgica y moviéndose hacia el exterior. A continuación, utilice un hisopo de algodón para frotar 70% de alcohol etílico en el sitio quirúrgico de la misma manera. Repetir dos veces.

2.3) La primera incisión

1. Una vez que el ratón está preparada, abra la bolsa de material estéril. Cambiar los guantes antes de touching los instrumentos. Saque el paño estéril y colocar los instrumentos en la tela. Si cualquier instrumento toca una superficie no-estériles, utilice el cordón esterilizador de vidrio durante 15 segundos para esterilizarlo.
2. Tome el bisturí en la mano y de gama contundente fórceps dominantes en la mano no dominante. Utilice las pinzas de gama contundente a suavemente agarre la piel del ratón, y hacer una incisión con el bisturí. Comience la incisión alrededor de 1,5 cm encima de las orejas (hacia la nariz) y se extienden a aproximadamente 0,5 cm por debajo de las orejas. Extienda la incisión vertical en la parte media de la cabeza del ratón para exponer bregma (Figura 1).
3. Una vez que se visualiza bregma, tome una punta de algodón estéril para eliminar suavemente sangre que cubre la superficie del cráneo. Use dos puntas de algodón para empujar la piel hacia el lado de la cabeza.

2.4) Configuración del equipo

1. Después de cualquier sangre se retira de la superficie del cráneo, y bregma se visualiza claramente, preparar la jeringa (CONcentración de 10 ⁸ TU / ml, volumen de 1 l). En la campana de humos, llenar la jeringa con el virus a inyectar. Asegúrese de que no hay burbujas en el interior. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxica, asegurándose de que está completamente asegurada.
2. Lentamente baje la jeringa hasta que está justo encima de la superficie del cráneo, de modo que la punta de la aguja de la jeringa estéril se establece en la intersección de la bregma y la línea interaural. Establezca este punto como cero, y determinar las coordenadas de este punto.
3. En función del área cerebral de interés, variar las coordenadas estereotáxica. Determinar estas coordenadas mediante la utilización de un atlas cerebral ^4. Una vez determinadas las coordenadas, mover la aguja de la jeringa para que coincida con esas coordenadas. Apunte el giro dentado utilizando las coordenadas: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Bajar la aguja a derecha por encima del cráneo para visualizar donde el agujero debe ser perforado.
4. Levante ligeramente la jeringa, tome el taladro y coloque la bi taladrot justo encima de la sitio de perforación de destino a aproximadamente un ángulo de 45 ° con el cráneo. Comienza la perforación, y mantener la perforación hasta que el cráneo da paso. Cuando el cráneo da paso, una caída en la resistencia puede ser detectado. Tenga cuidado de no perforar en el cerebro, a fin de evitar daños cortical.
5. Tome una punta de algodón estéril, y limpie toda la sangre del agujero.
6. Baje la jeringa para que la punta se encuentra justo en la superficie del cerebro (no el cráneo). Ajuste el D / V de coordenadas (profundidad) a 0. Bajo la jeringa a la profundidad deseada, sobre la base de las coordenadas atlas del cerebro. Para alcanzar el giro dentado, ajuste D / V a -1,79 mm.
7. Iniciar la inyección a una velocidad de 0,2 l / min. Ver para asegurar que la jeringa no se deslice más baja que la profundidad deseada. Si esto ocurre, elevar suavemente la jeringa hasta la profundidad deseada de nuevo.
8. Una vez finalizada la inyección, espere unos 2 minutos para asegurar que cualquier virus residual se haya absorbido. Levante lentamente la jeringa y utilizar una punta de algodón para eliminar cualquier liquid del sitio de inyección.
9. Repita para el otro hemisferio.

2.5) La sutura

1. Retire la sutura y aguja estériles de su embalaje y agarre la aguja utilizando los porta-agujas. Cara el borde puntiagudo de la aguja alejada de soporte de la aguja. Mantenga las pinzas de gama contundente en la mano no dominante, y lo utilizan para sujetar la piel en el ratón. Comience con la mano dominante.
2. Empuje suavemente la sutura a través de la piel y usar los fórceps-extremos romos para agarrar la piel en el otro lado de la incisión. Tire del material de sutura a través hasta aproximadamente 0,75 pulgadas permanece.
3. Suelte la aguja, y utilizar las pinzas de gama contundente para envolver la sutura alrededor del soporte de la aguja una vez, entonces, tomar la sutura restante 0,75 pulgadas con el soporte de la aguja, y tirar de la sutura a través de, por lo que el soporte de la aguja y la aguja terminar en el lado de la cabeza opuesta a la que estaban en un principio. Esto debería formar un nudo.
4. Repita este pasotres veces más, alternando el lado de la cabeza el soporte de la aguja termina en cada momento.
5. Cortar la sutura y repita los pasos 2.5.1-2.5.3 hasta que se cierra la incisión.

2.6) Cuidados después de la operación

1. Retire con cuidado las barras de oreja de ratón, y retire la mandíbula de la pinza anterior.
2. Mantenga el puntero del ratón sobre el cojín eléctrico hasta que se despierta y se mueve alrededor de su propio. Monitorear el ratón a diario, y mantener los ojos a los síntomas de dolor, como no arreglarse, comer o beber. Dé analgésico adicional cuando se considere necesario.

3. Prueba de campo abierto

3.1) Configurar

1. Obtener una plaza vacía, arena de plástico con dimensiones de 50 cm x 50 cm, con 50 cm altos muros (pero puede ser un poco más grande). Limpiar la arena con 70% de alcohol etílico antes del comienzo del experimento. Asegúrese de que el alcohol etílico se haya secado completamente antes de colocar un ratón en la arena.
2. Coloque la arena en lapiso, y tratar de garantizar la iluminación se ajusta para minimizar las sombras y reflejos.
3. Si utiliza software de seguimiento, coloque la cámara directamente sobre la cabeza del campo abierto, aproximadamente 1,5 pies por encima del campo abierto (lo suficientemente lejos para plena abarcan toda la arena, pero lo suficientemente cerca para tener una visión clara del ratón).
4. Establecer una zona en el centro de la caja (aproximadamente una superficie de 30 cm x 30 cm). ¹⁶ Para establecer una zona, haga clic en la pestaña de la zona 1 en el panel lateral.
   1. Seleccione un esquema forma en el panel superior, y delinear el perímetro de la zona centro. Seleccione añadir zona y haga clic en el interior de la zona centro. Usando las instrucciones del programa, el nombre de la zona (esto se conoce como "centro" para este procedimiento). Si la prueba de comportamiento se anotó a mano, asegúrese de que la parte inferior del campo se divide en 10 cm x 10 cm cuadrados, marcado con cinta.
5. Configure el software para que los ajustes son correctos, y el ratón es fácilmente visible en la pantalla. Lograr esto mediante el ajuste de la configuración de detección de la máquina para ser compatible con la arena de pruebas (iluminación) y color ratón.
   NOTA: Cuando los ajustes son correctos, el sistema debe realizar un seguimiento sólo el ratón, y no cualquier sombra o la orina / materia fecal. La configuración de software específicos dependen de la iluminación de la arena, y el color del ratón.

3.2) aclimatación y de ensayo

1. Mueva los ratones experimentales en el comportamiento sala 1 hora antes de la prueba con el fin de aclimatarse a su entorno. Deja los ratones en su jaula para la aclimatación.
2. Encienda la cámara para grabar la tarea conductual y colocar el puntero del ratón hacia la parte frontal medio de la arena para que el ratón se enfrenta a la pared.
3. Ajuste el temporizador de 5 minutos, y alejarse de la arena. Si es posible, salir de la habitación para no influir accidentalmente el ratón.
4. Una vez 5 minutos son, retire el ratón y colocarlos en su jaula.
5. Utilice 70% de alcohol etílico para limpiar a fondo de todo el campo antes de proceder a la siguiente ratón. Asegúrese de que el alcohol etílico se haya secado completamente.

3.3) Puntaje

1. Considere el ratón como estar en el centro del campo, cuando las cuatro patas están dentro del medio 30 cm x 30 cm.
2. Cuantificar la cantidad de tiempo que el ratón pasa en el centro. Por otra parte, determinar esta vez utilizando software de seguimiento (como Noldus ethovison).
   1. Para ello, vaya a la ficha de análisis, y haga clic en "movimiento" en los perfiles de análisis. Eliminar las categorías establecidas en la actualidad y, a continuación, seleccione "en la zona" en la ficha ubicación. Seleccione la zona centro. A continuación, seleccione "Salida de análisis" (bajo la etiqueta de resultados) para ver los resultados. Una tabla con el tiempo pasó inmóvil durante debería aparecer cada ensayo.
3. De lo contrario, la puntuación de la OFT a mano. El campo abierto debe tener 25 plazas 10 cm x 10 cm esbozados en la parte inferior de la opecampo n (como se indica en el paso 3.1.3). Cuantificar la cantidad de tiempo que el ratón pasa en el centro, además de el número de entradas en el centro de la arena. ¹⁶
   NOTA: El centro de 30 cm x 30 cm área es considerada el centro del campo abierto. Un ratón se considera que habita la región centro si las cuatro patas se encuentran dentro del área de 30 x 30 cm.

4. Forzada prueba de natación

NOTA: Permita un mínimo de cinco días entre las tareas de comportamiento.

4.1) Configurar

1. Obtener un 2 L claro cubo, y se llenan de 22 ° C el agua. Coloque el cubo sobre una mesa, y tratar de garantizar la iluminación se ajusta para minimizar las sombras y reflejos.
2. Si utiliza software de seguimiento, coloque la cámara directamente sobre la cabeza de la cuchara.
3. Configure el software de manera que el ratón es fácilmente visible en la pantalla.

4.2) aclimatación y de ensayo

1. Mueva ratones experimentales en el ro conductualom 1 hora antes de la prueba se adapte al entorno. Deja los ratones en su jaula para la aclimatación.
2. Encienda la cámara para grabar la tarea conductual. Con cuidado, coloque el ratón en el centro del cubo de agua. Asegúrese de no dejar caer el ratón. Baje lentamente el ratón, por lo que sus patas delanteras toquen el agua primero. Tenga cuidado para evitar que la cabeza de sumergir.
3. Ajuste el temporizador durante 6 minutos, y alejarse de la zona de comportamiento.
4. Una vez 6 min están arriba, quitar el ratón desde el cubo, y limpie el exceso de agua antes de colocar el ratón de nuevo en su jaula.

4.3) Puntaje

1. Si utiliza software de seguimiento, establecer ciento inmovilidad al 11%, según lo sugerido por Noldus (este debe ser el ajuste predeterminado), para cuantificar el tiempo flotando frente a la natación.
2. Para cuantificar utilizando el sistema de seguimiento, vaya a la ficha de análisis, y haga clic en movimiento bajo perfiles de análisis. Eliminar las categorías establecidas en la actualidad, a continuación, seleccione el estado de movilidad, enel panel lateral izquierdo (en el comportamiento individual). Establecer la inmovilidad a 11%.
3. Seleccione la visualización de pista, en la pestaña Resultados. Seleccione la salida de análisis (en la ficha resultados) para ver los resultados. Una tabla con el tiempo pasó inmóvil durante debería aparecer cada ensayo.
4. Si la puntuación parte, medir el tiempo que el ratón pasa la natación o la escalada, y la cantidad de tiempo que el ratón pasa inmóvil. Además, medir la latencia a la primera inmóvil tiempo. Consulte la Figura 2 en la sección Resultados.

Representative Results

Inyección estereotáctica exacto se basa principalmente en el establecimiento de las coordenadas correctas. La punta de la aguja usada para inyectar el virus debe establecerse directamente en la intersección de la bregma y la línea interaural (Figura 1). Es útil usar un microscopio estereoscópico para determinar si la aguja se coloca correctamente. Al mirar a través del microscopio, la aguja debe colocarse de modo que si se inyecta el virus, sería aterrizar directamente en la intersección de la bregma y la línea interaural. Es decir, la abertura de la aguja de la jeringa debe ser colocado directamente por encima de la intersección. En este estudio, un lentivirus expresar shRNA contra RBM8a, un factor principal en el complejo de unión exón, se inyectó en el giro dentado. El lentivirus también expresa RFP para etiquetar las neuronas infectadas. Figura 2 muestra que el virus se inyectó en la región correcta, como se indica por la señal de color rojo (Figura 3).

_content "> Para alcanzar significación en las tareas de comportamiento, el tamaño de la muestra debe cubre 12-15 ratones por grupo. tareas conductuales pueden llevar a cabo dos semanas después de las inyecciones de estereotaxia. En la OFT, un fenotipo ansioso está presente si los ratones pasan mucho menos tiempo en el centro del campo abierto en comparación con el grupo de control. Los resultados indican que desmontables de RBM8a en el giro dentado de ratones adultos conduce a comportamientos de ansiedad (p <0,05, Figura 4). En el FST, no hubo diferencia observable en la inmovilidad entre el control y los ratones experimentales, lo que sugiere que RBM8a caída en el giro dentado no afecta el comportamiento anti-depresivo (Figura 5). El análisis estadístico consistió en la realización de una varianza prueba t de dos muestras desiguales de dos colas.

Figura 1: Intersección de Bregma y el InterLínea auditiva. Para las inyecciones estereotáxica, la aguja de la jeringa debe estar alineado con la intersección de la bregma y la línea interaural. Este punto se ha fijado en cero.

Figura 2: Esquema ilustrativo de la línea de tiempo para el experimento completo.

Figura 3: cortes de cerebro Representante ilustrando inyección exitosa de virus en el giro dentado La barra de escala = 100 micras..

Figura 4: La cantidad de tiempo que los ratones control y experimentales de permanencia en el Centro de una novela campo abierto ratones experimentales pasan signif.vamente menos tiempo en el centro de la arena, lo que indica un fenotipo ansioso (N = 9-11, *, T ₁₈ = -2,72, p <0,05, media ± SEM)

Figura 5:. La cantidad de tiempo que los ratones control y experimental son inmóviles en la FST ratones experimentales no difieren de los controles en tiempo inmóvil (N = 9.11, T ₁₈ = 1,25, p> 0,05, media ± SEM)

Discussion

Inyecciones estereotáxicas exitosas se basan en tres factores: mantener el ratón vivo, estableciendo el punto cero correcto para las coordenadas (punta de la aguja en la intersección de bregma y la línea interaural) y ajuste de la profundidad adecuada para el punto cero (punta de la aguja apenas tocando el exterior del tejido cerebral). La viabilidad de los ratones es importante. Supervivencia cirugía puede ser ayudado por asegurarse de que el ratón es anestesiado correctamente y recibe analgésica adecuada. El dolor es conocido por ser una causa importante de mala recuperación después de la cirugía. Asegurar que el ratón está totalmente anestesiado durante la cirugía (no debe responder a pellizcos pies), y dando la dosis correcta de analgésicos (basado en el peso del ratón), debe ayudar a la supervivencia. ¹⁷ Además, el ratón debe mantenerse en una almohadilla térmica en todo el proceso de la cirugía hasta que despierte de la anestesia. Los ratones no puede regular su temperatura corporal cuando están anestesiados. Su cuerpo temperamentotura se reducirá de manera significativa durante el proceso de la cirugía. A pesar de que la duración de la cirugía estereotáctica es relativamente corto, la hipotermia podría perjudicar seriamente la supervivencia del ratón. La técnica apropiada sutura también es fundamental para la realización de una cirugía exitosa. Ratones tratará de recoger en sus suturas, lo que es crucial para asegurarse de que las suturas son lo suficientemente apretado para evitar la extracción, pero no demasiado apretado como poner demasiada tensión en la herida. Cuatro nudos en cada puntada deben asegurarse de que el ratón es incapaz de eliminar la sutura. Sutura adecuada es importante como una herida abierta aumentará la susceptibilidad a las infecciones, lo que afectaría negativamente a los experimentos de comportamiento.

El OFT es un paradigma de comportamiento diseñado para evaluar la locomoción y el fenotipo de ansiedad en ratones. Al probar el comportamiento del ratón, es importante tener mucho cuidado al manipular los ratones y la creación de la arena. En la OFT, el paradigma está diseñado para emparejar aprehensión del ratón cuando planeesn colocado en un nuevo entorno, con su natural curiosidad y el deseo de explorar la novedad. Un tipo ratón silvestre será inicialmente reticentes a entrar en el centro del campo, donde es más vulnerable, pero con el tiempo de hacerlo, debido a su curiosidad innata. En un ratón ansioso, la aprehensión de cruzar un espacio más vulnerable (el centro del campo) será mayor que su curiosidad natural y el deseo de explorar, lo que redundará en mucho menos tiempo de permanencia en el centro. Para asegurarse de que el paradigma funciona correctamente, es importante reducir al mínimo el estrés asociado a los factores distintos del campo abierto. El estrés puede ser minimizado al permitir que el ratón para aclimatarse a la sala de comportamiento (por lo que el ambiente exterior no es una variable de confusión es posible), y limpiar el campo entre los ratones, para garantizar que todos los olores asociados con el ratón anterior se han eliminado. ¹⁸ Estos pasos le ayudarán a eliminar las diferencias que son causadas por inadecuada handliratones NG. En este estudio, los ratones desmontables RBM8a pasaron significativamente menos tiempo en el centro de un campo abierto novela, en comparación con los controles. Esto es indicativo de un fenotipo ansioso, ya que los ratones son más reacios a entrar en el centro del campo abierto novela, donde son más vulnerables, en comparación con los controles.

El FST busca investigar el fenotipo anti-depresivo en ratones. Cuando se coloca en un cubo de agua, los ratones que pasan mucho menos tiempo flotando frente a la natación se considera que tienen un fenotipo anti-depresivo. La inmovilidad en la prueba de natación forzada se interpreta como la desesperación de comportamiento (por ejemplo, renunciar). Este paradigma es validado por el tratamiento antidepresivo. ^7,8,9 Los ratones que reciben medicamentos antidepresivos gastarán mucho menos tiempo flotando en comparación con los controles, lo cual es indicativo de un fenotipo anti-depresivo. En este estudio, los ratones RBM8a caída no difirió significativamente de los ratones de control en tiempo inmóvil. This indica que RBM8a caída en el giro dentado de ratones adultos no provoca un fenotipo depresivo, o anti-depresivo. En nuestro estudio anterior, RBM8a sobreexpresión en el giro dentado de ratones adultos disminuye significativamente inmóvil tiempo en comparación con los controles, lo que indica un efecto anti-depresivo. ¹⁶

Las inyecciones estereotáxicas usadas para la representación en este trabajo fueron el blanco de la circunvolución dentada. El giro dentado fue elegido como el sitio de destino, ya que el gen de interés es altamente expresado allí en el ratón adulto. Además, el giro dentado se ha asociado con la depresión y la ansiedad. Por ejemplo, un estudio utilizó ratones POMC-ChR2 para activan selectivamente las células granulares ya sea en el giro dentado dorsal o ventral. La activación de la tanto la dorsal y ventral dentado gyrus condujo a un aumento de la exploración de un nuevo entorno, lo que indica un papel potencial de la circunvolución dentada en la ansiedad. ¹⁹ Un estudio diferenteencontró que los ratones con una alteración de la neurogénesis había aumentado la inmovilidad en la FST, lo que indica un fenotipo depresivo. ²⁰ Por otra parte, la activación de Ap OA ₁ en el cerebro anterior conduce a un efecto anti-depresivo en la FST, la alimentación novedad suprimida, y la prueba de consumo de sacarosa. Cuando era VEGF-down noqueado en el giro dentado de Ap OA _1, este fenotipo anti-depresivo se perdió. ²¹ Estos datos sugieren que el giro dentado tiene un papel en la fisiopatología de la ansiedad y la depresión, e indicó que el giro dentado pueden ser una buena zona para apuntar a nuestro modulación genética y experimentos de comportamiento. A lentivirus se utilizó específicamente, de modo que todas las células en el giro dentado estarían infectadas, en comparación con células sólo se dividen (retrovirus).

Una combinación de estos tres diseños experimentales (además de otras tareas de comportamiento) es una forma novedosa para evaluar fenotipos de comportamiento en ratones, ya que un virus se puede inyectar en un specifárea del cerebro ic en momentos específicos del desarrollo. El uso de inyecciones estereotáxica de un lentivirus emparejado con tareas de comportamiento sólo toma unos pocos meses y permite a los investigadores para reunir datos preliminares sobre los efectos en el comportamiento de la expresión génica en un área específica del cerebro. En contraste, los ratones knockout condicionales a menudo toman años para generar. Por otra parte, el tipo de célula preferencia de virus se puede utilizar para apuntar además células. Por ejemplo, los retrovirus sólo pueden infectar células en división (tales como las células madre neurales en el giro dentado) mientras que un lentivirus infecta todos los tipos de células. ^22,23 Por lo tanto, junto con co-inyección, estos protocolos experimentales ampliamente utilizados y validados individualmente proporcionan una rápida pero de manera integral para poner a prueba el papel del gen específico en un área del cerebro específica, en los comportamientos del ratón.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder