L'applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali
Summary
Iniezione stereotassica di lentivirus esprimere cDNA o shRNAs possono modulare l'espressione genica in specifiche aree cerebrali di topi. Qui, vi presentiamo un protocollo per combinare iniezioni stereotassiche con compiti comportamentali, come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST).
Abstract
Iniezione stereotassica è una tecnica utile per fornire lentivirus ad alto titolo di aree cerebrali mirati nei topi. Lentivirus possono sia iperespressione o espressione genica atterramento in una regione relativamente concentrato, senza danni significativi al tessuto cerebrale. Dopo il recupero, il mouse iniettato può essere testato su vari compiti comportamentali come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST). L'OFT è progettato per valutare locomozione e il fenotipo ansia nei topi misurando la quantità di tempo che trascorre un topo nel centro di un campo aperto romanzo. Un topo più ansioso spenderà molto meno tempo nel centro del campo romanzo rispetto ai controlli. La FST valuta il fenotipo antidepressivo quantificando la quantità di tempo che i topi trascorrono immobile, quando sono immessi in un secchio d'acqua. Un mouse con un fenotipo antidepressivo spenderà molto meno tempo rispetto immobile agli animali di controllo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la STERiniezione eotactic di un lentivirus, in combinato disposto con test comportamentali per valutare come i fattori genetici modulare comportamenti animali.
Introduction
Il mouse è stato ampiamente utilizzato in neurobiologia perché è facile da manipolare geneticamente. Tecniche di Gene knockout permettono ai ricercatori di indagare come ogni fattore genetico dà forma comportamenti del mouse. Inoltre, il sistema cre-loxP fornisce uno strumento prezioso per tessutale e Cell tipo- knockout gene specifico nei topi, che consente ai ricercatori di studiare la funzione dei geni in diversi tessuti. 1 Tuttavia, in pratica, i modelli di espressione dei promotori CRE sono difficili da controllare , e finora molti driver cre stabiliti non hanno raggiunto l'espressione specifica regione. 2,3
In alternativa, l'iniezione stereotassica è un metodo che gli obiettivi di specifiche regioni cerebrali di topo adulto. Iniettando virus geneticamente modificati che esprimono cDNA o shRNA, regione specifica modulazione dell'espressione genica può essere raggiunto. Anche se le dimensioni del cervello di ogni mouse varia, la posizione di specifiche regioni cerebrali può essere determinato mediante coordi stereotassicanates impostato da punti di riferimento sul cranio del cervello di topo. I punti di riferimento più comunemente usati sono bregma, lambda, e la linea interaurale. Usando coordinate ottenute da un atlante del cervello, 4 la posizione esatta di ogni area del cervello può essere identificato dal antero-posteriore (A / P), medio-laterale (M / L), e dorso-ventrale (D / V) assi da bregma / interaurale intersezione linea. In genere i virus iniettato nel cervello dei topi sono etichettati con entrambi proteina fluorescente rosso o verde (RFP o GFP), in modo che le iniezioni possono essere confermate mediante microscopia a fluorescenza.
Sono particolarmente necessari per la ricerca di base di disturbi psichiatrici valutazioni comportamentali di topi. I sintomi di disturbi psichiatrici nei pazienti tipicamente coinvolgono comportamenti anomali. Alcuni di questi comportamenti umani sono evolutivamente conservati e possono essere imitate direttamente e osservato nel topo. Ad esempio, la depressione può essere modellato in topo misurando disperazione comportamentale. Le persone affette da depressione oftit si sentono come se nulla fanno potrà mai aiutare, un sintomo che può portare al suicidio. Nei roditori, questo può essere modellata utilizzando il nuoto forzato test (FST), che misura la quantità di tempo un mouse nuotare contro galleggiante in una vasca d'acqua (vista come rinunciare). Questo paradigma è convalidato dal salvataggio fenotipo con antidepressivi. 7,8,9 topi che hanno ricevuto antidepressivi spenderà molto meno tempo immobile rispetto ai controlli non trattati. Un altro test comportamentale, il Field Test Open (OFT) è progettato per valutare locomozione nei topi, e inoltre può essere utilizzato per analizzare il fenotipo ansia nei topi. 5,6 Questo test è basato sulla premessa che i topi sentono più sicuri quando sono vicini alla parete in un campo aperto romanzo. Topi wild-type alla fine di esplorare l'ambiente romanzo, in quanto sono animali curiosi. Tuttavia, spendere meno tempo nel centro del campo indica ansia nel topo, come il mouse non sarà in grado di superare la initial paura causata da un ambiente nuovo. L'ansia del mouse, come quantificato dalla quantità di tempo trascorso nel centro di un campo aperto, può essere paragonato ad ansia clinica nell'uomo, che è presente in molti disturbi psichiatrici.
La combinazione di iniezioni stereotassica con paradigmi comportamentali è un nuovo modo per alterare l'espressione di un gene specifico in una zona del cervello mirato. L'effetto dell'espressione genica modulata sui comportamenti del mouse può essere determinata. In contrasto intero knockout cervello, questo metodo è particolarmente utile in quanto si rivolge solo specifiche aree cerebrali. Inoltre, le iniezioni stereotassica sono tipicamente eseguiti nell'adulto tipo topo selvatico, di conseguenza, l'espressione del gene endogeno è stata mantenuta per tutta stadi di sviluppo. Questo metodo di evitare l'effetto confound se è richiesto il gene per la sopravvivenza nella fase embrionale o postnatale dello sviluppo. Una limitazione importante è che i topi sperimentali hanno bisogno di andare through un intervento chirurgico invasivo, in cui i crani di topi hanno da aprire. Inoltre, il grado di modulazione gene è determinata dal titolo e l'efficienza del virus. Il virus deve essere iniettato nella regione corretta usando coordinate stereotassica, che richiede strumenti speciali. La verifica del sito di iniezione corretta può essere completato solo post mortem.
Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per testare il coinvolgimento di un gene specifico in varie malattie neurologiche. Ad esempio, virale mediata RNAi mira il gene Th (che permette di sintetizzare la dopamina) è stato iniettato nel compacta sostanza nera, e l'analisi del comportamento motorio è stata condotta. 10 Un altro studio ha utilizzato l'iniezione stereotassica di un silenziamento DISC1 lentivirus per valutare il comportamento del mouse in relazione alla schizofrenia. Knockdown di DISC1 ha portato ad un aumento della locomozione in risposta alle novità (paralleli sintomi positivi nella schizofrenia), e una maggiore immobilità nellaFST. 11 Allo stesso modo, un ulteriore studio ha scoperto che 5-HT 1B sovraespressione ha portato ad un aumento comportamento esplorativo nella OFT, coerente con un fenotipo anti-ansia utilizzando questo metodo. 12 iniezioni stereotassica in grado di fornire il virus cre indurre ricombinazione in cre-loxP topi . Questo metodo è stato utilizzato per eliminare selettivamente il recettore Y2 nell'amigdala e il nucleo della stria terminale. Dopo l'analisi comportamentale, questi topi sono stati trovati a un fenotipo antidepressivo quando il gene è stato eliminato nell'amigdala centrale, ma non fenotipo quando il gene è stato eliminato nell'amigdala basolaterale o il letto nucleo della stria terminale. 13 Così, questa tecnica fornisce uno strumento unico per studiare l'effetto genetico sui comportamenti animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Iniezioni stereotassica di successo si basano su tre fattori: tenere il mouse viva, impostando il corretto punto zero per le coordinate (punta dell'ago sull'intersezione di bregma e la linea interaurale), e impostando la giusta profondità al punto zero (punta dell'ago sfiora l'esterno del tessuto cerebrale). La vitalità dei topi è importante. Sopravvivenza chirurgia può essere aiutata da fare in modo che il mouse sia correttamente anestetizzato e riceve adeguata analgesico. Il dolore è noto per esse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
References
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
- Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in sterotaxic coordinates. , (2001).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
- Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
- Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
- Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
- Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
- Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
- Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
- Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
- Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
- Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
- Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
- Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
- Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
- Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
- Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).
