基因枪转化是一种通过同源重组将DNA稳定整合到机会性病原体Cryptococcus neoformans基因组中的方法。我们将演示将一个编码乙酸激酶与荧光标签mCherry融合的基因构建体通过基因枪转化导入 C. neoformans的过程。
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本文内容
摘要
摘要
担子菌门真菌 新型隐球菌，一种中枢神经系统的侵袭性机会性病原体，是全球真菌性脑膜炎最常见的致病原因，每年导致全球超过62.5万人死亡。 尽管电穿孔技术已用于质粒转化 隐球菌，仅 基因枪法 递送提供 一种有效的转化方法 线性的 DNA 可通过同源重组整合到基因组中。
乙酸已被证明是隐球菌感染期间的主要发酵产物，但其意义尚不清楚。 在新生隐球菌（C. neoformans）中，存在三条可能的乙酸生成途径，其中之一是由木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶（Xfp）和乙酸激酶（Ack）组成的细菌型代谢途径。本文中，我们展示了通过基因枪法将一个携带编码Ack与荧光标签mCherry融合基因的构建体转化至 C. neoformans中的实验过程。随后，我们确认了ACK-mCherry融合基因已成功整合至 ACK 基因位点。
引言
新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种侵袭性的中枢神经系统机会性病原体，是导致真菌性脑膜炎的最常见原因，每年在全球造成超过62.5万人死亡1。已有研究表明，在隐球菌感染期间，乙酸是主要的发酵产物之一2,3,4，并且编码三条潜在乙酸生成途径中酶的基因在感染过程中被上调5。这提示乙酸的生成与转运可能是致病过程中的必要环节；然而，其具体意义尚不明确。其中一条可能的乙酸生成途径是木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶（Xfp）—乙酸激酶（Ack）途径，该途径此前被认为仅存在于细菌中，但最近已在包括 C. neoformans 在内的子囊菌和担子菌真菌中被发现6。
为了确定该通路中这些酶在细胞内的定位，构建了一个在新霉素抗性基因下游携带 ACK 将基因融合至荧光标签 mCherry（ACK:mCherry:Neo）并引入 C. neoformans 使用成熟的基因枪转化方法 7,8. 尽管电穿孔是一种将作为附加体维持的质粒高效转化的方法 隐球菌 9，它在创建稳定的同源转化子方面并无用处 8仅 基因枪法 基因枪递送 提供 一种有效的转化方法....
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方案
注意：本方案的整体流程见图1。
1. C. neoformans 的制备
- 每次转化反应中，在YPD培养基中于30 °C、250 rpm振荡条件下培养2-3 ml 新生隐球菌（C. neoformans）过夜培养物。
- 将过夜培养物在10 °C下以900 × g离心5分钟，并弃去上清液。
- 将每个细胞沉淀重悬于300 μl酵母胨葡萄糖（YPD）培养基中。
- 使用玻璃珠将300 μl洗涤后的细胞悬液轻轻涂布于含1 M山梨醇的YPD琼脂平板上。
- 让平板在室温下干燥3-4小时。
2. 金微载体的制备
- 将0.25 g的0.6 μm金珠重悬于1 ml ddH2O中，于900 × g离心1分钟以沉淀金珠，弃去上清液。
- 将金珠重悬于1 ml 100%乙醇中。
- 将金珠分装至4个离心管中，每管250 μl，并加入750 μl 100%乙醇。
- 将金珠分装液储存在4 °C。
3. DNA 制备
- 使用镊子将橙色宏载体基因枪圆片浸入100%乙醇中，以制备圆片。将圆....
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结果
按照本方案流程（图1），可成功实现对C. neoformans的基因枪转化。在基因枪转化过程中，若包被金微粒成功击发，可在DNA轰击后的培养板上观察到可见的金环，表明轰击成功（图2A）。将从YPD + 1M山梨醇平板中回收的细胞接种至选择性培养基后，在室温下培养4至5天内应出现菌落。使用2 µg DNA进行转化，通常可获得20至30个菌落（图2B）。当菌落出现后，应将其在选择性培养基上重新划线以分离单菌落。
单个菌落可在YPD培养基中培养，并可从这些细胞中分离DNA和RNA，通过PCR和RT-PCR分析以确认正确的整合与表达。若本实验方案用于标签基因融合（如此例所示），引物需分别结合于目的基因的编码区（引物2）和目的基因的3’非编码区（引物4）（图3A）。利用该构建体，PCR反应扩增出的DNA需进行测序，以进一步确认mCherry标签已与ACK基因正确地按读码框融合。阳性PCR结果表现为：从转化细胞中提取的DNA.......
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讨论
利用本方案，可通过基因枪转化技术实现线性DNA通过同源重组整合到Cryptococcus neoformans基因组的特定靶位点。方案中的某些步骤会对转化的效果或效率产生显著影响。为确保转化成功，用于轰击的DNA浓度必须至少达到1 µg。然而，若DNA得率低于1 µg，可增加加入金颗粒的DNA体积（步骤3.4）。
另一个重要步骤是金微粒的DNA包被。由于操作失误导致DNA制备样品中金微粒数量不足，会减少轰击到培养板上的DNA量。将DNA加载到金微粒上后，需用移液器将其转移至基因枪的载弹盘上，并使其自然干燥。干燥后，载弹盘上应出现一个直径约1 cm的可见金色圆环。若未观察到该圆环，提示金微粒的浓度过低。另一个提示金微粒浓度过低的迹象是在轰击后观察培养板：应能看到一个可见的金色环状痕迹（图2A）；如果未见金色环状痕迹且破裂盘已爆裂，则可能表明制备过程中所用金微粒的浓度过低。
使用基因枪转化法的典型产量为20-30个菌落。菌落数量较少可能表明该技术或基因枪装置的效率未达到100%。.......
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致谢
本工作获得了美国国家科学基金会（资助号：0920274）和南卡罗来纳州实验站项目 SC-1700340 的资助。本文为克莱姆森大学实验站第 6283 号技术贡献。作者感谢 Lukasz Kozubowski 博士在本最终方案开发过程中提供的有益建议，以及 Cheryl Ingram-Smith 博士、Katie Glenn 和 Grace Kisirkoi 对稿件的审阅与宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.6 μm 金珠 | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| 精胺游离碱 | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418-硫酸盐（新霉素） | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| 潮霉素 | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi 破裂盘 | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| 阻挡筛网 | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| 宏载体圆片 | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD 肉汤 | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| 琼脂 | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| 山梨醇 | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He 系统 | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| 显微镜 | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD 一步 PCR 试剂盒 | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| 一步 RT-PCR 试剂盒 | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒 | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy 小量试剂盒 | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 离心机 | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| 微孔板分光光度计 | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
参考文献
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al.
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重印与许可
