الأوكسجين الجلوكوز الحرمان وعودة التأكسج باعتبارها<em> في المختبر</em> الإسكيمية-ضخه من الإصابات نموذج لدراسة الدم في الدماغ الحاجز الجنسي لدى الرجال
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
ومن المعروف نقص التروية ضخه (IR) إصابة تسهم إسهاما كبيرا في معدلات الاعتلال والوفيات المرتبطة السكتات الدماغية الإقفارية. وتمثل الحوادث الوعائية الدماغية الإقفارية 80٪ من كل السكتات الدماغية. سبب شائع للإصابة IR هو التدفق السريع للسوائل بعد انسداد مزمن / حاد في الدم والمغذيات والأكسجين إلى الأنسجة مما ادى الى تكوين الجذور الحرة.
ويتبع السكتة الدماغية التي كتبها حاجز الدم في الدماغ (BBB) اختلال وظيفي وعائية المنشأ وذمة الدماغ. هيكليا، منعطفات ضيقة (TJS) بين الخلايا البطانية تلعب دورا هاما في الحفاظ على سلامة حاجز الدم في الدماغ (BBB). إصابة IR هو ضرر الثانوية في وقت مبكر يؤدي إلى استجابة التهابية غير محددة. الأكسدة والإجهاد الأيضي التالية التهاب يؤدي تلف في الدماغ الثانوي بما في ذلك نفاذية BBB وتعطيل تقاطع ضيق (TJ) النزاهة.
بروتوكول لدينا ويعرض في المختبر </ م> مثال على الحرمان من الأكسجين الجلوكوز وعودة التأكسج (OGD-R) على الخلايا البطانية دماغ الفئران TJ النزاهة وتشكيل الألياف الإجهاد. حاليا، يتم استخدام عدة تجريبية في النماذج الحية لدراسة آثار الإصابة IR. ولكن لديهم العديد من القيود، مثل التحديات التقنية في أداء العمليات الجراحية، الجينات الجزيئية تعتمد التأثيرات وصعوبة في دراسة العلاقات الميكانيكية. ومع ذلك، قد تساعد في المختبر نماذج في التغلب على كثير من تلك القيود. بروتوكول المعروضة يمكن استخدامها لدراسة مختلف الآليات الجزيئية والعلاقات الآلية لتوفير الاستراتيجيات العلاجية المحتملة. ومع ذلك، فإن نتائج الدراسات في المختبر قد تختلف من مستوى الدراسات المجراة وينبغي تفسيرها بحذر.
Introduction
تم العثور على نقص التروية ضخه (IR) إصابة أن يكون السبب كثرة من مختلف المضاعفات والوفيات الموهنة المرتبطة السكتة الدماغية، واحتشاء عضلة القلب، والصدمات النفسية، وأمراض الأوعية الدموية الطرفية وإصابات في الدماغ 1،2. إصابة IR في الأوعية الدماغية هو ضرر الثانوية في وقت مبكر مما يؤدي إلى الالتهاب و التورم 3. واحدة من المضاعفات الخطيرة التي تحدث نتيجة الأكسدة والإجهاد الأيضي التالية الالتهاب هو فقدان التوازن استتبابي مما يؤدي إلى تكوين الجذور الحرة، وتعديلات في حاجز الدم في الدماغ (BBB) منعطفات ضيقة (TJS) والاوعية الدموية الدقيقة نفاذية 4،5.
حاليا، في النماذج الحية تستخدم لدراسة آثار إصابة IR على BBB تشمل وسط انسداد الشريان الدماغي (MCAO)، microembolism، وراثيا أو خروج المغلوب الحيوانات. ومع ذلك، كل له عيوبه والتقييدات التي ناقشها Hossmann 6. يستخدم MCAO نموذج لدراسة يالحظالخبر من التوتر الأكسدة والاختزال، والتغيرات في مجال الاتصالات صلي من BBB والتفاعل بين الدماغ والخلايا المناعية. ومع ذلك، فإنها تشكل تحديات تقنية مختلفة مثل الحاجة إلى إجراءات المجهرية الدقيقة والصعوبات فيها. Microembolism يكسر الفور أسفل BBB بينما استخدام المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب الحيوانات لدراسة نقص التروية الدماغية قد يكون تحديات مثل التأثيرات التي تعتمد على الجينات الجزيئية في تشكيل احتشاء، والتغيرات في تشريح الأوعية الدموية ومتفاوتة وزن الجسم 6. وبالتالي، في المختبر نماذج من نقص التروية وجدت تزايد الاهتمام في الآونة الأخيرة يرجع ذلك أساسا إلى تطبيقها في إجراء الدراسات الميكانيكية للمخدرات. ومع ذلك، فإن نتائج الدراسات في المختبر قد لا تمثل تماما في الدراسة المجراة ويجب أن تفسر بحذر 6.
وقد أثر معاكس تركيزات الأكسجين المنخفضة على الطبقات الوحيدة الخلية البطانية ونفاذية الاوعية الدموية الدقيقةيدرسها اوجاوا 7. واستخدمت الخلايا البطانية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ (RBMECs) لتطوير في المختبر BBB. وقد تم تكييف الحرمان من الأكسجين الجلوكوز وعودة التأكسج (OGD-R) تقنية الواردة في هذا البروتوكول من الدراسات التي زولويتا وآخرون وتشو وآخرون 8،9. عرضنا الخلايا البطانية الدماغ لOGD-R عن طريق وضعها في غرفة نقص الأكسجة / نقص الأكسجين تحتوي على 0٪ O 2، 5٪ CO 2 و 95٪ N 2. تم تقييم الخلايا في وقت لاحق لإجراء تعديلات في TJ النزاهة والإجهاد تشكيل الألياف باستخدام توطين المناعي ووضع العلامات رودامين phalloidin على التوالي. يتم تنفيذ تلطيخ المناعي للنطيقة النطيقة-1 (ZO-1) لتحديد سلامة TJ، كما ZO-1 هو غشاء السقالات المهم المرتبط بالبروتين TJ. يحدد وضع العلامات رودامين Phalloidin الأكتين الخيطية (و -actin) في الهيكل الخلوي الخلية، وهو مؤشر واضح على أكتين تشكيل الألياف التوتر في الخلايا البطانية.
<ص الطبقة = "jove_content"> الهدف من هذه الطريقة هو توفير نظرة ثاقبة تطوير OGD-R كما في المختبر نموذج IR لدراسة BBB الخلايا البطانية TJ النزاهة وتشكيل الألياف الإجهاد و الأكتين. فإن النتائج توفر معلومات حول مصير البروتين TJ، ZO-1 وتشكيل الألياف الإجهاد التالية OGD-R. وفهم هذه العلاقات إتاحة الفرصة لتحديد الآليات الجزيئية الكامنة التي يتم تشغيلها بعد OGD-R وتطوير الاستراتيجيات العلاجية المحتملة لتعزيز تعطل BBB بعد العلاج OGD-R.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R لتكون نموذجا في المختبر لإصابة نقص التروية ضخه تم راسخة لدراسة الخلايا العصبية 10،11. هناك أيضا الدراسات التي تبين تأثير OGD على الخلايا البطانية الدماغ وتغييرات في النفاذية وTJ سلامة 9. ومع ذلك، تظهر دراستنا تأثير OGD وكذلك عودة التأكسج، وهو تمثيل أقر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف سكوت وبرنامج المنح البحثية مستشفى الأبيض للحصول على الدعم المالي وتكساس A & M مركز العلوم الصحية كلية طب المختبرات المتكاملة التصوير لاستخدام المجهر ليزر متحد البؤر. ونحن نعترف السيد غلين كراير للمساعدة في تحرير مخطوطة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
