Кислород-Глюкоза Лишение и реоксигенации в<em> In Vitro</em> Ишемии Травмы моделью для изучения гематоэнцефалического барьера дисфункции
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
Ишемии (ИК) травмы, как известно, в значительной мере способствовать заболеваемости и смертности, связанной с ишемических инсультов. Ишемические нарушения мозгового кровообращения приходится 80% всех инсультов. Распространенной причиной повреждения ИК является быстрое поступление жидкости после проведения острой / хронической окклюзии крови, питательных веществ, кислорода к ткани вызывая образование свободных радикалов.
Ишемический инсульт сопровождается гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) дисфункции и вазогенного отека мозга. Конструктивно плотные соединения (ТТ) между эндотелиальными клетками, играют важную роль в поддержании целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). ИК травмы рано вторичное повреждение приводит к неспецифической, воспалительной реакции. Окислительный стресс и метаболические следующие воспаления вызывает вторичное повреждение головного мозга в том числе BBB проницаемости и нарушение плотного контакта (TJ) целостности.
Наш протокол представляет в пробирке </ EM> пример кислорода-глюкозы лишения и реоксигенации (OGD-R) на мозг крыс эндотелиальных клеток TJ целостности и формирования стресс волокна. В настоящее время, несколько экспериментальных моделей в естественных условиях, используются для изучения влияния ИК травмы; Однако они имеют ряд ограничений, таких, как технические проблемы при выполнении операций, генные зависимые молекулярные влияния и трудности в изучении механистические отношения. Тем не менее, модели, в пробирке, может помочь в преодолении многих из этих ограничений. Представлены протокол может быть использован для изучения различных молекулярных механизмов и механических связей для обеспечения потенциальных терапевтических стратегий. Тем не менее, результаты исследований в пробирке, может отличаться от стандартных в естественных исследований и их следует интерпретировать с осторожностью.
Introduction
Ишемии (ИК) травма оказалась частой причиной различных изнурительных осложнений и смертей, связанных с инсультом, инфарктом миокарда, травмы, заболевания периферических сосудов и черепно-мозговой травмой 1,2. ИК травмы в мозговых сосудах в начале вторичное повреждение приводит к воспалению и отеку 3. Одним из серьезных осложнений, которые происходит в результате окислительной и метаболического стресса следующей воспаления является потеря гомеостаза баланса, ведущего к образованию свободных радикалов, изменения в гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) плотные соединения (ТТ) и микрососудов проницаемости 4,5.
В настоящее время в естественных условиях модели, используемые для изучения последствий ИК травмы на BBB включают окклюзии средней мозговой артерии (MCAO), микроэмболии и трансгенных или нокаутом животных. Тем не менее, каждый из них имеет свои недостатки и ограничения, как описано в Hossmann 6. МСАО модель используется для изучения эфТС окислительно-восстановительного стресса, изменения в соединительных коммуникаций BBB и взаимодействия между мозгом и иммунных клеток. Тем не менее, они представляют различные технические проблемы, такие как необходимость точных микрохирургических операций и трудности в нем. Микроэмболии мгновенно разрушает BBB, а использование трансгенных животных или нокаут, чтобы изучить церебральной ишемии может иметь проблемы, как ген-зависимым молекулярных воздействий на формирование инфаркта, изменения в сосудистой анатомии и различных масс тела 6. Следовательно, модели в пробирке ишемии нашли повышенный интерес в последние времена в основном за счет их применимости в выполнении механистические исследования на наркотики. Тем не менее, результаты исследований в пробирке не может в полной мере представляют собой исследование в естественных условиях и должны быть интерпретированы с осторожностью 6.
Противодействующий эффект низких концентраций кислорода на поверхности эндотелиальных клеток монослоя и микрососудов проницаемости былиизучены Огава 7. Крыса мозг микрососудистых эндотелиальных клеток (RBMECs) были использованы для разработки в пробирке BBB. Лишение кислород глюкозы и реоксигенации техника (OGD-R), представленные в этом протоколе была адаптирована из исследований Зулуэта др и Чжу и др 8,9. Мы разоблачили эндотелиальных клеток головного мозга в OGD-R, помещая их в гипоксия / аноксии камеру, содержащую 0% O 2, 5% СО 2 и 95% N 2. Клетки позже оценивали изменения в целостности и стресс формирования волокна с использованием иммунофлюоресценции TJ локализации и родамин фаллоидином маркировку соответственно. Иммунофлуоресценции окрашивание блокатора малой зоны 1 (ZO-1) выполняется для определения целостности TJ, а ZO-1 является важным леса мембраной т белка. Родамин фаллоидином маркировка определяет нитчатые актин (F-актина) в клеточной цитоскелета и четкое указание актина формирования стресс волокна в эндотелиальных клетках.
<р = класс "jove_content"> Цель данного метода является дать представление разработки OGD-R в качестве экстракорпорального ИК модели для изучения ВВВ эндотелиальных клеток целостность TJ и образование Ф-актина стресс волокна. Результаты будут предоставлять информацию о судьбе TJ белка, ZO-1 и формирование стресс волокна следующие OGD-R. Понимание этих отношений даст возможность, чтобы определить основные молекулярные механизмы, которые запускаются следующие OGD-R и развивать потенциальные терапевтические стратегии по повышению нарушения ВВВ после лечения OGD-R.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R как модель в пробирке для ишемии реперфузии была хорошо известна для изучения нейроны 10,11. Есть также исследования, показывающие влияние OGD на эндотелиальных клетках головного мозга и изменения в проницаемости и целостности TJ 9. Тем не менее, наше исследование показ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем, Скотт и Белый больницы программу исследовательских грантов для финансовой поддержки и Техас & M Научного центра здоровья Медицинского колледжа интегрированной лаборатории изображений для использования конфокальной лазерной микроскопии. Мы признаем, г-н Глен Крайер за помощь в рукописи редактирования.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
