Isolamento e Transplante de diferentes envelhecidas murino tímicos enxertos.
Summary
This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
Abstract
Os mecanismos que regulam a eficácia da selecção do timo permanecem mal definidos. O método aqui apresentado permite em análises in vivo do desenvolvimento e selecção das células T específicas para auto-antigénios e estrangeiras. A abordagem implica o implante de enxertos de timo derivados de várias ratos envelhecidos em recipientes SCID imunodeficientes. Ao longo de um período relativamente curto de tempo, os destinatários são completamente reconstituído com células T derivadas do enxerto de timo implantado. Apenas timócitos semeando o timo no momento de isolamento submetidos a selecção e se desenvolvem em células T maduras. Como tal, as alterações na natureza e especificidade das células T enxertadas como uma função do timo de eventos dependentes da idade, pode ser avaliada. Embora perícia técnica é necessária para o transplante bem sucedido do timo, este método proporciona uma estratégia única para o estudo in vivo, uma vasta gama de patologias que são devido a um resultado ou de função e / ou aberrante do timo homeostasé.
Introduction
O timo é um órgão em que os eventos críticos no desenvolvimento de células T ocorrem 1. Timócitos residente, mediante rearranjo do receptor de células T (TCR) e dos genes α β, passam por uma série de interacções com lymphostromal e células apresentadoras de antigénio (APC) nas regiões corticais e medulares do timo 2. Selecção positiva tímico é mediada por células epiteliais tímicas corticais (TEC) para produzir timócitos que reconhecem péptidos antigénicos no contexto do complexo de histocompatibilidade principal hospedeiro (MHC) de classe I e moléculas II 2-3. Subsequente selecção tímica negativa envolve purga de timócitos auto-reactivas, impulsionado por uma interacção com a TEC medular ou células dendríticas (DC) que apresentam péptidos derivados de auto-proteínas ligadas por MHC de classe I e moléculas 3 II. O resultado final destes processos é o estabelecimento de uma pool de células maduras CD4 + e CD8 + T capazes de responder a um espectro amplode antigénios estranhos enquanto exibem reactividade mínima para auto-proteínas 4.
A eficiência de eventos de selecção do timo é influenciada por uma série de factores, incluindo maturação do timo, a frequência de medular e cortical do TCE, composição subconjunto de DC timo, e a fonte de precursores do timo 3. Notavelmente, a seleção do timo aberrante pode resultar em auto-imunes 5 ou imunodeficientes patologias, que surgem a partir de selecção negativa ou positiva prejudicada, respectivamente. Os eventos moleculares que regulam a selecção tímica, no entanto, são pouco compreendidos. Em abordagens in vitro, tais como culturas de órgãos tímicos reaggregate (RTOC) 6, têm provado ser úteis para analisar os acontecimentos básicos associados com a selecção tímica, mas não totalmente recapitular a dinâmica do curso em eventos in vivo. Como resultado, esta abordagem baseada em transplante de timo foi criada para melhores eventos estudo de seleção de timócitos in vivo 7 </sup>.
Este protocolo descreve o transplante thymi de camundongos recém-nascidos e adultos doadores em ratinhos receptores SCID imunodeficientes. Esta técnica permite o estudo de mecanismos que regulam a selecção tímica positiva e negativa, bem como a saída do timo de vários subconjuntos de células T durante a ontogenia. Mais recentemente, esta abordagem tem sido utilizado para demonstrar que a eficácia de selecção tímica é limitado logo depois do nascimento em ratinhos conduz a um aumento do desenvolvimento de células T auto-reactivas, e um reduzido repertório de células T específicas para antigenes estranhos 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Materials
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
