İzolasyon ve Farklı Yaşlı Fare Timik Greft Nakli.
Summary
This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
Abstract
timik seçim etkinliğini düzenleyen mekanizmalar kötü tanımlanmış kalır. in vivo kendi kendine ve yabancı antijenleri için spesifik T hücrelerinin gelişmesine ve seçim analizleri burada sunulan yöntem sağlar. yaklaşım immünyetmezligi scid alıcıların içine çeşitli yaşlı farelerde türetilen timik greft implantasyonu gerektirir. Süresi nispeten kısa bir süre boyunca alıcı tam implante timus greft türetilen T hücreleri ile yeniden oluşturulmuştur. Sadece timositler, izolasyon anında timus tohum seçimi geçmesi ve olgun T hücreleri dönüşür. Bu nedenle, yaşa bağlı timik olayların bir fonksiyonu olarak aşılanan T hücrelerinin yapısı ve özgüllük değişiklikler değerlendirilebilir. Teknik uzmanlık başarılı timik transplantasyonu için gerekli olsa da, bu yöntem, in vivo olarak anormal timik fonksiyonu ve / veya homeostas sonucunda ya da bağlı olan patolojilerin geniş bir çalışma için benzersiz bir strateji sağlarolduğunu.
Introduction
Timus T hücre gelişiminde kritik olaylar 1 meydana geldiği bir organdır. Yerleşik timositleri, T hücresi reseptörü (TCR) α ve β genlerin tekrar düzenlenmesi üzerine timus 2 kortikal ve medüller bölgelerde lymphostromal ve antijen sunan hücreler (APC) ile etkileşimlerin, bir dizi geçer. Timus pozitif seçim ana majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I ve II moleküllerinin 2-3 bağlamında antijenik peptitleri tanıyan timositleri üretilmesi için kortikal timik epitelyum hücreleri (TEC) aracılık eder. Daha sonra timik negatif seçim medüller TEC veya dendritik hücrelerin (DC), MHC sınıf I ve II moleküllerinin 3 ile bağlanmış kendi proteinlerinden türetilen bu, mevcut peptidler ile bir etkileşim ile tahrik edilen reaktif timositlerin tasfiye gerektirir. Bu işlemlerin bir sonucudur geniş bir yelpazede cevap verebilmek olgun CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin bir havuz kurulmasıyabancı antijenlere kendi kendine proteinlerin 4 minimal reaktiviteye sahip iken.
timik seçim olayları verimliliği timus olgunlaşması, meduller ve kortikal TEC, timik DC alt kümesi bileşiminin sıklığı ve timik öncüleri 3 kaynağı gibi faktörlerin, bir dizi etkilenir. Özellikle, anormal timik seçim sırasıyla, bozulmuş negatif veya pozitif seçimden kaynaklanan otoimmun 5 veya immünyetmezligi patolojiler, neden olabilir. timik seçimi düzenleyen moleküler olaylar, ancak tam olarak anlaşılamamıştır. In vitro böyle reaggregate timik organ kültürleri (RTOC) 6 olarak yaklaşımları, timik seçimi ile ilgili temel olayları analiz etmek için yararlı olabilir, ancak tam sürmekte dinamiklerini recapitulate başarısız kanıtlanmıştır in vivo olaylarda. Sonuç olarak, bu timik transplantasyon dayalı yaklaşım, in vivo 7 daha iyi çalışma timosit seçim olayları için kurulmuştur </s> yedekleyin.
Bu protokol bağışık yetmezliği scid alıcı farelere yenidoğan ve yetişkin donör farelerin Thymi nakli açıklanır. Bu teknik, pozitif ve negatif timik seçimi, hem de ontogeny sırasında çeşitli T hücresi alt kümelerinin timik çıkış düzenleyen mekanizmaların çalışmasına izin verir. En son olarak, bu yaklaşım, timik Seçimin verimi, erken otoreaktif T hücrelerinin artan gelişmesine yol açan, farelerde doğumdan sonra sınırlı olduğunu göstermek için kullanılır ve yabancı antijenlere 7 için azaltılmış T hücresi repertuarı spesifik edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Materials
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
