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Medicine

माउस ग्लूकोमा में Confocal Ophthalmoscopic इमेजिंग और सेल morphometry: neurodegeneration के दौरान रेटिना microglial सक्रियण के vivo गतिशीलता में

Published: May 11, 2015
doi:
10.3791/52731
, , ,
1Department of Neurobiology & Anatomy,University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences,University of Utah

Summary

Microglia सक्रियण और microgliosis पुरानी neurodegeneration करने के लिए महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया कर रहे हैं। यहाँ, हम इन विवो, कोंफोकल ophthalmoscopy द्वारा रेटिना CX3CR1-+ GFP microglial कोशिकाओं की लंबी अवधि के दृश्य के लिए तरीके मौजूद है, और सीमा और morphometric के लिए पहचान करने और उनके सक्रियण यों के लिए विश्लेषण करती है। हम उम्र से संबंधित मोतियाबिंद के प्रारंभिक दौर के दौरान microglial परिवर्तन की निगरानी।

Abstract

सीएनएस निवासी neuroimmune कोशिकाएं हैं जो Microglia, विशिष्ट कार्यों और जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ एक सक्रिय राज्य के लिए स्विचन, सीएनएस क्षति के जवाब में उनकी आकृति विज्ञान और आकार बदलना। स्वास्थ्य, चोट और बीमारी में microglial सक्रियण की भूमिका अधूरे होने के कारण उनके microenvironment में बदलाव के जवाब में उनके गतिशील और जटिल विनियमन समझा रहते हैं। इस प्रकार, यह गैर invasively पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है और बरकरार जीव में समय के साथ microglial सक्रियण में परिवर्तन का विश्लेषण। विवो में microglial सक्रियण की पढ़ाई सीएनएस वातावरण बदलने के बिना ट्रैकिंग microglial व्यवहार करने के लिए तकनीकी सीमाओं की देरी हो चुकी है। इस लंबी अवधि में परिवर्तन लगाया जाना चाहिए जहां पुरानी neurodegeneration के दौरान विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है। रेटिना, गैर इनवेसिव रहते इमेजिंग के लिए उत्तरदायी एक सीएनएस अंग, कल्पना और पुरानी बीमारियों के दौरान microglia सक्रियण की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करता है।

<p clगधा = "jove_content"> इस प्रोटोकॉल लंबी अवधि के रेटिना microglia की, vivo इमेजिंग, सेलुलर संकल्प के साथ microglia कल्पना करने के लिए, कोंफोकल ophthalmoscopy (cSLO) और CX3CR1 GFP / + संवाददाता चूहों का उपयोग करने के लिए तरीके की रूपरेखा। इसके अलावा, हम बड़े सेल सबसेट में सेल सक्रियण और घनत्व में मासिक परिवर्तन (रेटिना प्रति 200-300 कोशिकाओं) यों की विधियों का वर्णन। हम इन विवो छवियों की स्वचालित दहलीज आधारित morphometric विश्लेषण लगाने से रेटिना में microglial सक्रियण का जीना नज़र रखने के लिए एक उपयोगी मीट्रिक के रूप में somal क्षेत्र के उपयोग की पुष्टि करें। हम इन लाइव छवि अधिग्रहण का उपयोग करें और जीर्ण मोतियाबिंद के एक माउस मॉडल में रेटिना neurodegeneration के प्रारंभिक दौर के दौरान microglial सक्रियण और microgliosis में गतिशील परिवर्तन की निगरानी करने के लिए रणनीति का विश्लेषण करती है। यह दृष्टिकोण रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका को प्रभावित करने वाले पुरानी सीएनएस विकारों में neuronal और axonal गिरावट के लिए microglia की योगदान की जांच के लिए उपयोगी होना चाहिए।

Introduction

Microglia विशेष रूप से जल्दी भ्रूण के विकास के बाद से और वयस्कता के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में रहते हैं कि neuroimmune कोशिकाओं रहे हैं। रिसेप्टर्स की एक जटिल प्रदर्शनों की सूची से लैस है, microglial गतिविधि और क्षेत्रीय विविधता पड़ोसी न्यूरॉन्स, glia, रक्त मस्तिष्क बाधा और neuroinflammatory कोशिकाओं 1,2 घुसपैठ के साथ अपने द्विदिश परस्पर क्रिया द्वारा विनियमित रहे हैं। वे समस्थिति 3,4 में perturbations के लिए अपने क्षेत्र का नमूना के रूप में बेसल microglial कार्य, शारीरिक रखरखाव और मरम्मत के लिए योगदान करते हैं। सीएनएस चोट या बीमारी के दौरान, microglia तो एक प्रतिक्रियाशील फेनोटाइप को अपने संक्रमण है कि ट्रिगर न्यूरोनल संकेतों के लिए पहली responders हैं, "microglia 2,5-7 सक्रिय करार दिया। Microglia सक्रियण सेल सोम और प्रक्रिया आकार और 6-9 remodeling के लिए मिलकर कर रहे हैं, जो जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति, की एक जटिल चक्र शामिल है। Microglia सक्रियण, साथ ही सेल पुनर्वितरण औरक्लस्टरिंग, कोशिकाओं की संख्या (करार दिया microgliosis) में स्थानीय समग्र वृद्धि के साथ जा सकता है। इस के साथ या रक्त प्राप्त monocytes 3,4,7,10-14 की भर्ती के बिना सेल प्रसार और आत्म नवीकरण, से परिणाम कर सकते हैं। उम्र पर निर्भर है, पुरानी सीएनएस रोगों की एक विस्तृत रेंज में, microgliosis और microglia सक्रियण समानांतर रोग प्रगति 15-19 निरंतर। कैसे microglia प्रभाव neurodegeneration वे रोग शुरुआत और प्रगति के लिए विविध योगदान हो सकता है कि दोनों न्यूरोप्रोटेक्टिव और हानिकारक भूमिका निभाते हैं, जिसका मुख्य कारण स्पष्ट नहीं हुआ है। पुरानी सीएनएस बीमारी को समझने के उद्देश्य से लाइव इमेजिंग अध्ययन पशु मॉडल और मनुष्यों के क्षतिग्रस्त सीएनएस में microglial व्यवहार पर नजर रखी, और microglial परिवर्तन जल्दी रोग के चरणों 15-17,19,20 में पहचाने जाने लगे हैं प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, यह पता लगाने के लिए और इन विवो में microglial सक्रियण की निगरानी करने के लिए दृष्टिकोण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

गैर इनवेसिव देतेमस्तिष्क microglia सक्रियण में क्षेत्रीय परिवर्तन की ction के आणविक इमेजिंग या bioluminescence और पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग 18,21,22 का उपयोग कर, neurodegenerative रोग प्रगति का सूचक विवो में एक महत्वपूर्ण के रूप में स्थापित किया गया था। ये बेहद मात्रात्मक और गैर इनवेसिव आणविक और परमाणु इमेजिंग तरीकों क्षेत्रीय संकल्प के साथ gliosis का पता लगाने। वैकल्पिक रूप से, CX3CR1 GFP + / चूहों में दो photon इमेजिंग confocal सेलुलर संकल्प 3,4,9,20,23-28 के साथ मस्तिष्क microglia के अवलोकन की अनुमति दी है। हालांकि, इस दृष्टिकोण भी कम आक्रामक ब्रेन इमेजिंग प्रक्रियाओं के 29 से उनके व्यवहार को परेशान करने के संभावित खतरे को देखते हुए लंबी अवधि के और क्रोनिक microglial परिवर्तन के दोहराया अवलोकन सीमित करता है। वैकल्पिक रूप से, रेटिना गंभीर चोट निम्नलिखित विवो दृश्य में प्रत्यक्ष के लिए इष्टतम स्थितियों, और उम्र बढ़ने भर में उनके बरकरार सीएनएस आला में microglia की दोहराया निगरानी प्रदान करता है, औरसंभवतः पुरानी neurodegenerative रोगों के दौरान। इस प्रकार, हाल के अध्ययनों से छवि के लिए confocal स्कैनिंग लेजर ophthalmoscopy (cSLO) लाइव CX3CR1 GFP / + चूहों आदत डाल द्वारा व्यक्त GFP रेटिना microglia की उच्च संकल्प इमेजिंग की व्यवहार्यता साबित कर दिया है। इस तीव्रता से प्रेरित चोट या आंख का उच्च रक्तचाप 30-36 निम्नलिखित अप करने के लिए 10 सप्ताह के लिए व्यक्तिगत चूहों में + GFP सेल नंबर में साप्ताहिक परिवर्तन ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

हम कई महीनों से अधिक लंबी अवधि के लिए इमेजिंग प्रदर्शन, और मात्रात्मक morphometric विश्लेषण का उपयोग सोमा आकार के आधार पर microglia सक्रियण में परिवर्तन ट्रैक करने के लिए इस दृष्टिकोण का विस्तार किया है। Somal आकार CX3CR1-+ GFP microglia 9 के vivo इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए cortical स्लाइस में दो फोटॉन confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग रहते इमेजिंग अध्ययन में microglia सक्रियण के एक उपयोगी मीट्रिक के रूप में परिभाषित किया गया था। ये और अन्य अध्ययनों से यह भी क, somal आकार और Iba1 प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के बीच संबंध का प्रदर्शनआईसीएच भी सक्रियण 9,37 के साथ बढ़ जाती है। इस प्रकार, सक्रिय microglia लाइव चूहों में पहचाना जा सकता है, और उनकी संख्या और वितरण सीएनएस स्वास्थ्य और रोग के दौरान समय के साथ नजर रखी।

इस प्रोटोकॉल cSLO लाइव छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए तरीके microglial सेल नंबर, रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल (RGC) अध: पतन (चित्रा 1) के दौरान वितरण और रूपात्मक सक्रियण की निगरानी करने का वर्णन है। इस प्रकार, इस अध्ययन का उपयोग करता है: 1) उम्र पर निर्भर ऑप्टिक तंत्रिका और रेटिना neurodegeneration और प्रक्रिया से गुजरता है कि विरासत में मिला मोतियाबिंद (डी बी ए / 2J) के एक माउस मॉडल उम्र 38,39 के 5 और 10 महीने के बीच रोग प्रगति में उल्लेखनीय परिवर्तनशीलता से पता चलता है, 2) मासिक लंबी अवधि के रेटिना में GFP + कोशिकाओं के दृश्य और 3-5 महीने, सेल somata और उपाय को अलग करने के विभाजन और thresholding द्वारा 3) रहते इमेजिंग विश्लेषण आयु वर्ग के विषमयुग्मजी Cx3cr1 GFP / + डी बी ए / 2J चूहों के बिना मेलिनकृत ऑप्टिक तंत्रिका के लिए cSLO vivo इमेजिंगआईआर क्षेत्र। इन रणनीतियों जीर्ण मोतियाबिंद के प्रारंभिक दौर के दौरान रेटिना microglial सक्रियण राज्यों के कैनेटीक्स का आकलन करने के लिए लागू कर रहे हैं।

Protocol

विवो में इमेजिंग यूटा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग रोगज़नक़ मुक्त सुविधाओं में किया जाता है। नोट: इस इमेजिंग प्रोटोकॉल रेटिना microgl…

Representative Results

हमारे हाल के vivo में पढ़ाई के लिए कल्पना और देर neurodegeneration से 59 जीर्ण मोतियाबिंद और उनके रिश्ते के प्रारंभिक दौर के दौरान कैनेटीक्स और ONH और रेटिना microglial परिवर्तन के पैटर्न को ट्रैक करने के लिए इन जीवित छ…

Discussion

एक neurodegenerative रोग दौरान microglial सेल नंबर और रूपात्मक सक्रियण की लाइव निगरानी सेल सुविधाओं का विस्तृत दृश्य की अनुमति है कि गैर इनवेसिव इमेजिंग तरीकों के उपयोग की आवश्यकता है। इमेजिंग के बाद, microglial कोशिकाओं microglia …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and
CX3CR1-GFP/+ mice		 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.
301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4ºC for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1%  Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01
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Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).
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