Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
Durante l'infezione e l'infiammazione, monociti circolanti lasciano il flusso sanguigno e migrare nei tessuti, dove si differenziano in macrofagi. I macrofagi esprimono i recettori di superficie Toll-like (TLR), che riconoscono pattern molecolari conservate attraverso l'evoluzione in una vasta gamma di microrganismi. TLR svolgono un ruolo centrale nella attivazione dei macrofagi, che è di solito associata con l'espressione genica alterazione. I macrofagi sono fondamentali per molte malattie e sono emersi come bersagli attraenti per la terapia. Nel seguente protocollo, si descrive una procedura per isolare i macrofagi peritoneali murini utilizzando medio Thioglycollate di birra. Quest'ultimo incrementare la migrazione dei monociti nel peritoneo, di conseguenza tale da far salire il rendimento dei macrofagi per 10 volte. Diversi studi sono stati condotti utilizzando midollo osseo, milza o peritoneali derivati da macrofagi. Tuttavia, i macrofagi peritoneali hanno dimostrato di essere più maturo sull'isolamento e sono più stabili nella loro funzionalitàlità e fenotipo. Così, macrofagi isolati da murino cavità peritoneale presentano una popolazione importante cella che può servire in diversi studi immunologici e metabolici. Una volta isolato, i macrofagi sono state stimolate con differenti ligandi TLR e di conseguenza l'espressione del gene è stata valutata.
Introduction
Il sistema reticoloendoteliale fagocitica è composto di cellule in vari tessuti ed organi come il midollo osseo, sangue, fegato e milza. I macrofagi sono ampiamente distribuiti in tutto il corpo, dove in particolare partecipano innata e risposte immunitarie per il controllo e le infezioni chiare. Oltre al loro ruolo nella difesa dell'ospite, macrofagi giocano un ruolo importante nella guarigione delle ferite e nel mantenimento dell'omeostasi tissutale 1,2. Inoltre, i macrofagi non sono importanti solo per la funzione immunitaria, ma anche partecipare attivamente nell'omeostasi del ferro 3. Nel corpo, circa il 80% di ferro è presente in emoglobina entro eritrociti, che quando sono senescente fagocitato dai macrofagi 4. Ogni giorno, i macrofagi riciclare 25 mg di ferro eritrociti di derivazione e di fornire il suo trasporto nel plasma 5. Inoltre, durante l'infezione e l'infiammazione, macrofagi pro-infiammatori sequestrano sideremia per ridurre DISPONIBIL ferroty agli agenti patogeni, sia a livello sistemico e locale 6-8. Inoltre, studi hanno dimostrato che i macrofagi e soprattutto epatociti producono un peptide antimicrobico denominato hepcidin che è considerato il principale regolatore del metabolismo del ferro 9, 10. Hepcidin è aumentato principalmente da stimoli infiammatori ed è parzialmente responsabile per il sequestro di ferro in macrofagi su infiammazione cronica 11-13. Come espressione di epcidina in macrofagi non è molto ben compreso, abbiamo studiato il possibile ruolo dei recettori Toll-like (TLR) nel presente regolamento. I TLR si trovano principalmente sui macrofagi e svolgono un ruolo centrale nella loro attivazione. Inoltre, LPS espressione hepcidin indotta nel fegato è dipendente TLR4 13. Pertanto, per eseguire il nostro studio, abbiamo usato un metodo basato sull'isolamento dei macrofagi peritoneali murini.
Linee di cellule macrofagi sono ampiamente utilizzati in stallone macrofagiies; tuttavia la cultura estesa può provocare la perdita di geni e diminuzione delle funzioni immunitarie in queste linee cellulari. Pertanto, l'isolamento dei macrofagi dalla cavità peritoneale è cruciale.
La cavità peritoneale del mouse presenta un luogo ideale per raccogliere i macrofagi 13-15. Isolati macrofagi peritoneali murini sono convenienti per diversi studi riguardanti la loro funzione immunologica. Tuttavia, il numero di macrofagi nel peritoneo è insufficiente per studi approfonditi ed è stimata intorno a 1 x 10 6 macrofagi per topo. Pertanto, per aumentare la produzione di macrofagi, un agente suscitando sterile come tioglicolato stato iniettato nella cavità peritoneale precedente il raccolto cella. Dopo l'iniezione tioglicolato, la resa dei macrofagi per mouse è stato aumentato di 10 volte. Nonostante l'aumento dei macrofagi rendimento, Thioglycollate atti medio di birra come irritante che induce una risposta infiammatoria, con conseguente reclutamento di macrofagi, che may ma non necessario influenzano l'espressione genica. Quindi, un gruppo di controllo costituito da macrofagi non trattata deve essere incluso in ogni esperimento. Nelle nostre mani, espressione di epcidina che è altamente stimolata da infiammazione non è stato rilevato in Thioglycollate non trattato suscitato macrofagi peritoneali. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che il tioglicollato di birra recluta numerosi macrofagi, ma non attiva le 16. D'altra parte, tioglicolato di Brewer suscitato macrofagi hanno mostrato un aumento enzima lisosomiale ma una diminuzione uccidendo i microrganismi ingeriti 17. Tuttavia, la capacità dei fagociti non è stata influenzata se confrontato con i macrofagi non suscitato 16.
Una volta coltivate in piatti, i macrofagi peritoneali diventano aderenti, consentendo quindi la loro separazione da altri tipi di cellule isolate dalla cavità peritoneale. Successivamente, i macrofagi isolati si sono sfidati con diversi agonisti TLR.Infine, mRNA è stato estratto dalle cellule in coltura e l'espressione genica è stato analizzato utilizzando reazione inversa quantitativa a catena transcriptasi-polimerasi (qRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
I macrofagi sono cruciali per la sopravvivenza e fornire un bersaglio allettante per manipolare l'host per obiettivi immunologici. La scoperta di TLR e di altre molecole di riconoscimento hanno condotto i macrofagi al centro del dibattito immunologica. Macrofagi rispondono ad una varietà di stimoli, compresi citochine, molecole danni associati molecolari modello (smorza) 20 e molecole associate a gruppi di patogeni (PAMP) 21. Queste diverse risposte stimoli rappresentano corso dell'attivaz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC, concedere senza 298515-2011). AL è il destinatario di un dottorato di ricerca borsa di studio le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC), e MS è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Canadian Institutes of Health Research (CIHR, concessione n. MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
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