Abstract
感染症や炎症の間、循環単球は、血流を離れ、彼らはマクロファージに分化する組織へと移行します。マクロファージは、微生物の広い範囲の進化を通じて保存された分子パターンを認識し、表面のToll様受容体（TLR）を発現します。 TLRは、通常、遺伝子発現の変化に関連しているマクロファージの活性化において中心的な役割を果たしています。マクロファージは、多くの疾患において重要であり、治療のための魅力的な標的として浮上しています。以下のプロトコルでは、我々はビールチオグリコール酸培地を用いてマウスの腹腔マクロファージを単離するための手順が記載されています。後者は、それに応じて、これは10倍マクロファージ収量を発生させます、腹膜への単球の移行を後押しします。いくつかの研究は、骨髄、脾臓または腹腔由来マクロファージを用いて行われてきました。しかし、腹腔マクロファージは、分離の際に、より成熟したことが示されており、それらの機能に、より安定しているし、性と表現型。このように、マウスの腹腔から単離されたマクロファージは、異なる免疫学的および代謝の研究に役立つことができる重要な細胞集団を提示します。単離されると、マクロファージは、異なるTLRリガンドで刺激し、その結果、遺伝子発現を評価しました。
Introduction
細網内皮系の貪食は、骨髄、血液、肝臓および脾臓のような種々の組織および器官中の細胞から構成されています。マクロファージは広く、彼らは特に制御する自然免疫と適応免疫応答と明確な感染症に関与体の周りに分布しています。宿主防御におけるそれらの役割に加えて、マクロファージはまた、創傷治癒および組織の恒常性1,2-維持に重要な役割を果たしています。さらに、マクロファージだけでなく、免疫機能に重要であるだけでなく、積極的に鉄ホメオスタシス3に参加しています。本体では、鉄の約80％は、老化がマクロファージ4によって貪食される赤血球内のヘモグロビンに存在します。毎日、これらのマクロファージは赤血球由来の鉄25mgをリサイクルし、プラズマ5にその輸送を提供しています。また、感染および炎症の間、前炎症性マクロファージ鉄availabiliを減少させるために血清鉄を封鎖します両方の全身および地域レベル6-8で病原体へのTY。マクロファージおよび主に肝細胞が鉄代謝9、10のマスターレギュレーターであると考えられるヘプシジンという名前の抗菌ペプチドを生成することだけでなく、研究が示されています。ヘプシジンは、主に炎症性刺激によって増加し、慢性炎症11-13時のマクロファージにおける鉄の隔離のために部分的に責任があるされています。マクロファージにおけるヘプシジンの発現は非常によく理解されていないとして、我々はこの調節におけるToll様受容体（TLR）の役割の可能性を検討しました。 TLRは主にマクロファージで発見し、それらの活性化において中心的な役割を果たしています。また、肝臓におけるLPS誘導性のヘプシジン発現は、TLR4 13に依存しています。したがって、我々の研究を実行するために、我々は、マウスの腹腔マクロファージの単離に基づく方法を使用していました。
マクロファージ細胞株は広くマクロファージスタッドに使用されていますIES;それにもかかわらず、拡張培養は、遺伝子の損失を誘発し、これらの細胞株における免疫機能を低下させることができます。このように、腹腔からマクロファージの単離は非常に重要です。
マウス腹腔マクロファージ13-15を収穫するのに理想的なサイトを紹介します。単離されたマウス腹腔マクロファージは、その免疫学的機能に関するいくつかの研究のために便利です。しかし、腹膜におけるマクロファージの数は、鋭意研 究のために不十分であり、マウス当たり約1×10 6のマクロファージが推定されます。したがって、マクロファージの出力を上げるために、例えば、チオグリコール酸のような滅菌誘発剤は、細胞の収穫の前に腹腔内に注射しました。チオグリコレート注射後、マウスのマクロファージあたりの収量は10倍増加しました。マクロファージ収量、マクロファージの動員、マサチューセッツ州で、その結果、炎症反応を誘導する刺激としてビールチオグリコール酸培地行為の増加にもかかわらず、Yが、必須ではないが、遺伝子発現に影響を与えます。したがって、未処理マクロファージからなる対照群を各実験に含めなければなりません。私たちの手で、非常に炎症によって刺激されるヘプシジン発現は、非処置チオグリコール酸では検出されなかった腹腔マクロファージを誘発しました。また、研究では、ビールチオグリコール酸は、多数のマクロファージを動員するが、それらに16を活性化しないことが示されています。一方、ブリューワーのチオグリコール酸は、マクロファージは、リソソーム酵素の増加が、摂取した微生物17を殺すの減少を示した誘発しました。非誘発マクロファージ16と比較した場合しかし、貪食能は影響を受けませんでした。
皿で培養した後、腹腔マクロファージは、したがって、腹膜腔から単離された細胞の他のタイプからそれらの分離を可能にする、接着性になります。続いて、単離されたマクロファージは、異なるTLRのアゴニストで攻撃しました。最後に、mRNAを培養細胞から抽出し、遺伝子発現は、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）を用いて分析しました。
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Protocol
すべての手順は、センターデRECHERCHEデュセンターHospitalierドゥモントリオール大学（CRCHUM）の動物実験委員会の承認を得た後、動物飼育ガイドラインにカナダ議会に従って行われました。
1.単離、同定、およびマウス腹腔マクロファージの文化
- 3.8％のビールチオグリコール酸培地を準備します。これを行うには、蒸留水1000mlにチオグリコール酸培地の38グラムを中断。完全培地を溶解するために沸騰するソリューションを持参してください。 121℃で15分間オートクレーブで滅菌します。 RT 18で、暗所で3ヶ月まで保管してください。
注：濁度は細菌汚染を示している開発した場合は廃棄してください。無菌に保つ場合に溶液は暗所で1年まで維持することができます。 - 各畝の腹腔内に3.8％ブリューワーチオグリコール酸培地の1ミリリットルを注入し、23 Gの針に取り付けられた1ミリリットル注射器を使用して、SEと3日間待ちます。各マウスについて、新しい注射器と針を使用してください。
- ペントバルビタールナトリウム（100mg / kg）の腹腔内注射によりマウスを麻酔し、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。呼吸数をチェックして、適切な麻酔を確認してください。通常、急速な呼吸マウスが深く麻酔されていないことを示しています。
- 70％エタノールで各マウスの腹部を洗います。はさみを使用して、腹膜の下正中線に沿って横方向の切開を行います。
- 鉗子を使用して、透明な腹膜肌を露出させるために腹部の皮膚を引き戻します。 20 G針に取り付けられた5ミリリットルの注射器を用いて、各マウスの腹腔内に冷DPBSを5ml注入します。
- 腹膜腔に穏やかなマッサージを行い、その後、任意の器官を穿刺することなく、慎重に流体を吸引します。針を外し、50mlのコニカル遠心チューブに腹水を分注します。
- 冷却遠心機で400×gで10分間遠心分離します。細胞は、全手順の間に冷たいままにする必要があります。上清を捨て、RPMI培地1640中で細胞ペレットを再懸濁します。
- 血球計数器を使用して、細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの細胞密度に調整します。
- F4 / 80に対するマウスとantibodieあたり1×10 6個の細胞（マクロファージに発現される表面抗原）を用いてフローサイトメトリーにより単離された細胞の表現型を特徴づけます。
2.細胞処置
- 直接、単離後、各ウェルに1×10 6個の細胞を追加します。 37℃で1〜2時間のためにそれらを培養することにより、6ウェルプレートに付着したマウス腹腔マクロファージのままにしておきます。優しく温かいPBSで3回洗浄して非接着細胞を除去します。
- 次のTLRリガンドの存在下で、24時間900μlの無血清DMEM中で続いて、培養細胞：（Pam3CSK4-TLR1 / 2（0.5 mg / mlの）;ポリ（I：C）-TLR3（10 mg / mlの） ; LPS-TLR4（100ng / mlの）フラジェリンTLR5（100ng / mlの）FSL1-TLR6 / 2（100ng / mlの） ssRNA40-TLR7（1 / mlの）; ODN1826-TLR9（1μM）。
注：各リガンドのための10×ストック溶液を準備します。このように10倍希釈を行うことにより、各ウェルに、後者の100μlを添加します。
3. RNAの単離
- 各ウェルに1ミリリットルのTRIzolを添加し、ピペットを介して細胞溶解液を数回通過させることにより、6ウェルプレート中で直接すべての培地および溶解細胞を除去します。核タンパク質複合体を完全に解離可能にするために、室温で5から10分間均質化したサンプルをインキュベートします。
- 1.5ミリリットルのRNaseおよびDNaseをフリーのマイクロ遠心チューブにライセートを転送します。 1ミリリットルののTRIzolあたり0.2ミリリットルのクロロホルムを追加します。 15秒間手で激しく管を振って5から10分間、室温でそれらを培養します。 4℃で15分間、12,000×gで遠心分離します。下の赤相（フェノール - クロロホルム）、間期、無色上部の水相に分離する混合物を観察します。 RNAは水相でのみ残ります。
- トラン相間を乱すことなく、新鮮なチューブにsferは慎重に上部の水相。イソプロピルアルコール0.5 mlを混合して、そこからRNAを沈殿させます。 4℃で10分間、12,000×gで10分間遠心分離室温でサンプルをインキュベートします。 RNAは、チューブの側面と底に白い沈殿物を形成する沈殿します。
- 上清を取り除きます。 75％エタノール1mlで一度RNAペレットを洗浄します。 4℃で5分間、7,500×gでボルテックスし、遠心分離することにより、サンプルを混ぜます。簡単に言えば、RNA（10分間空気乾燥）を乾燥させます。 0.1ミリリットルDEPC（RNアーゼを含まない水）でRNAを溶解し、55℃で10分間インキュベートします。
- 分光光度計を用いてRNAを定量化します。これを行うには、サンプルをDEPC水で100倍に希釈し、260nmの波長で読み取りました。 RNA濃度は、その後、次のようになります。OD 260×40 NG / UL X希釈係数を。
- RNA濃度を均一化し、第一鎖cDNA合成キットをRT-PCRシステムを用いて、製造業者の指示に従ってcDNAを合成。として製造者の指示に従って、リアルタイムDNA検出システムでリアルタイムPCR（45サイクル）によって遺伝子のmRNAレベルを測定します。例えばβアクチンおよびGAPDHのための2つのハウスキーピング遺伝子との遺伝子発現レベルを標準化。
注：ミリリットルを500μg/にRNA濃度を正規化し、cDNA合成のための0.5μgを使用します。
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Representative Results
まず、フローサイトメトリーによって単離されたマウス腹腔マクロファージを特徴とします。これを行うには、我々は、具体的にのみマクロファージによって発現されるマーカーを認識する（F4 / 80）抗体を使用していました。この特徴付けは、単離されたマクロファージの割合を決定し、分離プロセス中に得られた細胞の間で区別するために必要とされます。 （ 図1）に示されるように、/ 80抗原F4を発現する細胞の割合は、常に95％以上であることが判明しました。 Pam3CSK4（TLR1 / 2）、LPS（TLR4）とFSL1（TLR6 / 2）：次に、マクロファージにおける遺伝子発現を研究するために、単離された細胞は、いくつかのTLRリガンドで処理しました。次いで、ヘプシジン（ ハンプ ）、関心の我々の遺伝子のmRNAレベルは、RT-PCRによって測定しました。 （ 図2）に示すように、TLR1 / 2は、TLR4およびTLR6 / 2リガンドは、マウスマクロファージ19ヘプシジンのmRNAを刺激することができました。一緒に、これらの結果は、成功へのこのプロトコルの有用性を実証しますLYマウス腹腔マクロファージを単離し、正確な遺伝子発現の分子の調節を調査します。
腹腔マクロファージを回収した。濃縮から単離された細胞の特徴付け図1は、CD16 / CD32抗体との非特異的染色をブロックした後、F4 / 80抗体を用いたフローサイトメトリー分析によって確認したと一貫して95％を超えることが見出されました。
図2 TLRは、マウス腹腔マクロファージにおけるヘプシジン発現を誘導リガンド。TLR1 / 2でのマウス腹腔マクロファージの単離及び刺激の後、TLR4およびTLR6 / 2リガンドは、ヘプシジンmRNAレベルは、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によって調べました。データは平均±SEMとして提示されています。ND（検出できません）。 * P <0.05対コントロール（Ctrlキー）。結果は、独立して行う3同様の実験を代表するものです。
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Discussion
マクロファージは、生存のために重要であり、免疫学的目的のためのホストを操作するための魅力的な標的を提供します。のTLRおよび他の認識分子の発見は、免疫学的議論の中心にマクロファージを行いました。マクロファージは、サイトカイン、ダメージ関連分子パターン分子（DAMPS）20および病原体（のPAMPs）21のグループに関連する分子を含む種々の刺激に応答します。これらの異なる刺激応答は、マクロファージ活性化の経過を表し、通常は遺伝子発現22の急激な変化と関連しています。
非炎症状態では、マクロファージの大部分は体内での戦略的な場所に存在します。これらは、全ての組織及び血液中の単球を循環させるように求めることができます。したがって、マクロファージは、微生物の侵入のための最も影響を受けやすい部位に存在しています。
宿主の防御は、Iと記載されています古典的なマクロファージの活性化に関連する細胞内病原体の排除にnflammatory応答。マクロファージの古典的な活性化は、炎症誘発性M1マクロファージ分極につながるTh1サイトカイン環境におけるリポ多糖のような微生物産物によって誘導されます。組織損傷における炎症の結果の永続性と宿主の生存に必要な抗炎症メカニズムの開発。したがって、Th2サイトカインは、次いで、阻害し、調節M1応答を、そしてまた、組織の修復を促進する抗炎症M2マクロファージの偏光の導入を可能にします。このホワイトペーパーに記載されているプロトコルでは、腹腔内チオグリコール酸注射は、古典的な炎症カスケードを刺激し、M1マクロファージの動員につながります。
これまでに、いくつかの研究は、骨髄、脾臓または腹腔由来マクロファージを用いて行われてきました。これらのマクロファージはheterogeneを表します様々な活動と組織単位（OU）の集団。その形態や表面 の分子特性に基づいて、研究では、腹腔マクロファージは骨髄および脾臓由来マクロファージ23よりも成熟していることを立証しました。由来のマクロファージ、脾臓とは異なりと腹膜、骨髄由来マクロファージはpahgocytosisと増殖の顕著な能力を提示し、完全マクロファージ前駆細胞20,24,25と区別することができます。また、骨髄マクロファージの単離は、長寿命で均質な収率を提供します。一方、これらのマクロファージが完全に特徴付けられていないと実験研究におけるそれらの使用は、それらの表現型の心変わりによる合併症を提示し、26を機能します。骨髄由来のマクロファージ、脾臓および腹膜マクロファージとは異なり、より機能的および23表現型安定であるように見えます。
マウス腹腔マクロファージのしたがって、単離CAN異なる免疫学的研究、遺伝子発現解析に役立ちます。また、マウスの腹腔に常駐マクロファージ27を回収するための理想的なサイトを提供します。しかし、誘発数は中程度とマウスあたり1×10 6のマクロファージの周りに推定されます。したがって、マクロファージの収穫を増加させるために、例えば、チオグリコール酸などの誘発剤を3日間細胞単離の前に28腹腔内注射しました。このエージェントは、炎症反応を誘発し、それに応じてマクロファージの収穫が増加します。
これは、任意の器官を穿刺することなく、ゆっくりと腹水を回収する前に、腹腔に穏やかなマッサージを行うことが不可欠です。最大の可能な量を引き出すことは最大の細胞数を収集するために必要とされます。血液汚染の場合には、溶解緩衝液は、赤血球を廃棄する手順の最後に使用することができます。誘発マクロファージは、その後フローcytometrを特徴とすることができます Yは、F4 / 80マクロファージに固有の抗原に対する抗体を使用して。
手順では、すべての試薬は、エンドトキシンフリーで、すべての動物が永久的に特定の病原体を含まない条件下で飼育したことを確認してください。前差し迫った実験とマクロファージの刺激は著しく結果分析が変更されますので、病原体を含まない条件下でこの手順を実行することが重要です。
単離された後、腹腔マクロファージは、炎症性サイトカインの産生、食作用、細胞シグナル伝達、遺伝子発現、走化性および毒物学29を含むいくつかの研究で使用することができます。例えば、異なるTLRリガンドで刺激した後、我々は誘発マクロファージにおいてヘプシジンという名前の鉄代謝の重要な調節因子の分子調節を検討しました。 24時間の細胞処理後、全RNAをTRIzol試薬を用いて単離し、遺伝子発現は、定量RT-PCRを用いて分析しました。
_content ">我々はTLRを活性化し、遺伝子発現を研究していたように、無血清DMEMの使用が推奨されています。無血清培地は、汚染物質の程度を減少させ、感染性病原体のいずれかの潜在的な原因を排除します。RNAの単離にもかかわらず、簡単な工程、リボヌクレアーゼおよびDNA汚染はRNAの分解を防止し、正確な定量RT-PCRの結果を達成するために避けなければならないと思われます。 DNAの混入を検出するための最良の方法は、RT-PCR実験の各RNAサンプルのための「マイナスRT」コントロールを含めることです。 PCR産物は、その後、逆転写されなかった製品が混入DNAから増幅したRNAサンプルから生成された場合。 DNA汚染の場合には、DNase処理の使用が可能です。それは新たに合成されたDNAを分解しないようにしかし、DNアーゼは完全にRT-PCR前に不活性化されなければなりません。
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Acknowledgments
この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC、何の298515から2011を付与していない）からの助成金によってサポートされていました。 ALは博士の受信者であります自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）から奨学金、およびMSは、カナダ衛生研究所からの助成金からサポートされていました（無許可、CIHR。MOP123246）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
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