जहरीले रसायनों को प्रदर्शन के बाद Endothelial सेल प्रवासन का आकलन
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
(सल्फर और नाइट्रोजन सरसों की तरह क्षारीकरण रासायनिक युद्ध एजेंटों सहित) रासायनिक पदार्थों के संपर्क में घाव भरने के विकार सहित नैदानिक लक्षणों में से एक बहुतायत के कारण। घाव भरने की शारीरिक प्रक्रिया बेहद जटिल है। या तो vasculogenesis के माध्यम से (उपन्यास संरचना) या एंजियोजिनेसिस (मौजूदा जहाजों की अंकुरण) – दानेदार बनाने का कार्य ऊतक के गठन के लिए एक प्रारंभिक घाव बंद में जिसके परिणामस्वरूप और एक नया केशिका रक्त वाहिकाओं के नेटवर्क उपलब्ध कराने के लिए इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। दोनों vasculo- और angiogenesis endothelial कोशिकाओं के कार्यात्मक, निर्देशित प्रवास की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, जल्दी endothelial सेल (ईईसी) प्रवास की जांच संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए उपन्यास रणनीतियों की पहचान विकारों के उपचार रासायनिक प्रेरित घाव के pathophysiology को समझने और करने के लिए महत्वपूर्ण है।
हम एजेंट जोखिम क्षारीकरण के बाद बिगड़ा घाव भरने का मूल्यांकन और tr के लिए संभावित उम्मीदवार के यौगिकों का परीक्षण कियाeatment। हम इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीकों का एक सेट का इस्तेमाल किया। एक संशोधित Boyden कक्ष मात्रात्मक ईईसी की chemokinesis वर्णन किया गया है जांच करने के लिए। इसके अलावा, गुणात्मक प्रवास का आकलन करने के लिए ट्रैक विश्लेषण के साथ संयोजन में परख घाव भरने के उपयोग सचित्र है। अंत में, हम परेशान सेल प्रवास के अंतर्निहित तंत्र की पहचान करने के लिए mitochondrial झिल्ली क्षमता की जांच के लिए फ्लोरोसेंट डाई TMRM के उपयोग के प्रदर्शन। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ईईसी की जांच के लिए अनुकूलित किया गया है कि बुनियादी तकनीकों का वर्णन है।
Introduction
सेल प्रवास त्वचा की चोट के बाद विकास, विभिन्न रोगों, और घाव भरने सहित कई शारीरिक और pathophysiological प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण है।
त्वचा की चोट के बाद, सूजन क्षतिग्रस्त या परिगलित ऊतक और दानेदार बनाने का कार्य ड्राइव प्रारंभिक घाव बंद निकालता है और vasculogenesis के माध्यम से नए केशिकाओं के एक नेटवर्क के गठन (उपन्यास संरचना) या एंजियोजिनेसिस (मौजूदा vesicles के अंकुरण) 1-3 की अनुमति देता है। दोनों vasculo- और angiogenesis endothelial कोशिकाओं के पलायन की आवश्यकता होती है। रक्त वाहिकाओं के बढ़ते नेटवर्क अंततः keratinization गुजरना जो केरेटिनकोशिकाओं proliferating को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के परिवहन के लिए आवश्यक है, एक नया उपकला फार्म और घाव बंद प्रदान करते हैं।
Endothelial कोशिकाओं का बिगड़ा प्रवास विकार 4,5 घाव भरने का एक मुख्य कारण है। जल्दी endothelial कोशिकाओं के प्रकार, विधियों का आकलन करने के लिए प्रवास pathophysiol का पता लगाने के लिए आवश्यक हैंसेल प्रवास विकारों के ogy और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए उपन्यास रणनीतियों की पहचान करने के लिए।
क्षारीकरण एजेंट (जैसे, सल्फर और नाइट्रोजन सरसों) के लिए चमड़े का जोखिम विकार 6 घाव भरने का कारण बनता है। ऐसे यौगिकों के कारण राजनीतिक रूप से अस्थिर क्षेत्रों और अपेक्षाकृत सरल संश्लेषण में मौजूदा जरिए मजबूत करने के लिए चिंता का कारण यह है कि 20 वीं सदी में कई संघर्षों में रासायनिक युद्ध एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया और रहना गया। सल्फर सरसों पहले 1822 में संश्लेषित किया गया था हालांकि, एसएम जोखिम के आणविक और क्लीनिकल पैथोलॉजी में विस्तार से समझा नहीं गया है और एस.एम. लोगों तक पहुंचाने के लिए कोई मारक पहचान की गई है।
कई अध्ययनों से समझने के लिए और एस.एम. प्रदर्शन के बाद बिगड़ा घाव भरने के लिए मॉडल और प्रभाव है कि आरक्षण के लिए सक्षम संभावित उम्मीदवार यौगिकों के लिए परीक्षण करने के लिए आयोजित किया गया है। श्मिट एट अल। (2009) क्लोरैम्बुसिल का असर, समझौता ज्ञापन में एसएम करने के लिए इसी तरह की संपत्ति के साथ एक क्षारीकरण यौगिक का परीक्षण कियाएसई embryoid शरीर मॉडल और पोत गठन 7 में एक नाटकीय, कभी कभी अधिक से अधिक 99% की कमी पाया। इस प्रतिकूल प्रभाव सबसे अधिक है, शारीरिक शर्तों के तहत, प्रसार और संवहनी endothelial अग्रदूत कोशिकाओं के प्रवास का प्रभुत्व है जो विकास के चरण में घोषित किया गया था। इस प्रकार, इन कोशिकाओं एजेंटों क्षारीकरण करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील होने की पहचान की गई। Steinritz एट अल। (2010) के लिए, माउस embryoid शरीर मॉडल में और विशेष रूप से एस एम विषाक्तता को कम करने की क्षमता के लिए विशेष रूप से, एन एसिटाइलसिस्टीन (एनएसी) और अल्फा लिनोलेनिक एसिड (ALA) में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), के मैला ढोने वालों का परीक्षण किया पोत गठन 8 बहाल। अस्थाई सुरक्षात्मक प्रभाव अत्यधिक आरओएस गठन के घाव भरने पर एस.एम. के प्रतिकूल प्रभाव के लिए योगदान करने की संभावना थी यह दर्शाता है कि मनाया गया। इन प्रभावों को स्थायी नहीं थे और दो उम्मीदवार यौगिकों दीर्घकालिक 8 में पोत गठन और घाव भरने को बहाल करने में सक्षम नहीं हो सकता है। Howeveआर, उन प्रयोगों सेल प्रवास के जांच की अनुमति देने के लिए किया था, जो एक जटिल 3 डी मॉडल में आयोजित की गई। इस प्रकार, हम बाद में पोत गठन 9 की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका है कि ईईसी की सेल प्रवास पर लाभकारी प्रभाव के लिए एनएसी और पक्षक का परीक्षण किया।
इसके अलावा, सेल polarity सेल प्रवास के लिए आवश्यक है कि सबूत नहीं है। आरओएस गठन के लिए अग्रणी mitochondrial रोग सेल polarity ख़राब करने के लिए दिखाया गया था और इस तरह प्रतिकूल सेल प्रवास को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, mitochondrial समारोह के संबंध में रहते सेल इमेजिंग प्रदर्शन किया था और आरओएस मैला ढोने वालों के प्रभावों की जांच की गई। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ईईसी, Boyden कक्ष परख, सेल ट्रैकिंग के विश्लेषण और विस्तार से mitochondrial समारोह के आकलन के लिए TMRM के उपयोग सहित परख घाव भरने की खेती के लिए सामान्य आवश्यकताओं का वर्णन है। ईईसी खेती और प्रवास के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं को उजागर कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जहरीले रसायनों के लिए चमड़े का जोखिम अक्सर गंभीर घाव भरने विकार में यह परिणाम है। अंतर्निहित तंत्र काफी हद तक अनजान हैं। घाव भरने के विभिन्न चरणों (रक्तस्तम्भन, सूजन, प्रसार और remodeling) के होते हैं कि एक जट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
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