Bedömning av endotelcellmigration Efter exponering för giftiga kemikalier
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
Exponering för kemiska ämnen (inklusive alkylerande kemiska stridsmedel som svavel- och kvävesenaps) orsaka en uppsjö av kliniska symtom inklusive sårläkningsstörning. Den fysiologiska sårläkningsprocessen är mycket komplex. Bildandet av granulationsvävnad är ett viktigt steg i denna process resulterar i en preliminär sårtillslutning och ger ett nätverk av nya kapillära blodkärl – antingen genom vaskulogenes (roman bildning) eller angiogenes (groning av befintliga fartyg). Både vasculo- och angiogenes kräver en funktionell, riktad migrering av endotelceller. Således är utredning av tidig endotelceller (EEG) migration viktigt att förstå patofysiologin av kemikalieberoende sårläkningsstörningar och eventuellt identifiera nya strategier för terapeutisk intervention.
Vi bedömde försämrad sårläkning efter alkyleringsmedel exponering och testade potentiella kandidatföreningar för treatment. Vi använde en uppsättning tekniker som beskrivs i detta protokoll. En modifierad Boyden kammare för att kvantitativt undersöka kemokines av EEG beskrivs. Dessutom är användningen av sårläknings analys i kombination med spåranalys för att kvalitativt utvärdera migrerings illustreras. Slutligen visar vi användning av fluorescerande färgämne TMRM för utredning av mitokondriell membranpotential för att identifiera bakomliggande mekanismer för störd cellmigration. Följande protokoll beskriver grundläggande tekniker som har anpassats för utredning av EEG.
Introduction
Cell migration är viktigt i många fysiologiska och patofysiologiska processer inklusive utveckling, olika sjukdomar och sårläkning efter hudskada.
Efter hudskada, avlägsnar inflammation skadade eller nekrotisk vävnad och granulering enheter preliminära sårtillslutning och möjliggör bildandet av ett nätverk av nya kapillärer genom vaskulogenes (ny formation) eller angiogenes (groning av befintliga vesiklar) 1-3. Både vasculo- och angiogenes kräver migration av endotelceller. Den växande nätverk av blodkärl är avgörande för att transportera syre och näringsämnen till prolifererande keratinocyter som slutligen genomgår keratinisering, bilda en ny epitel och ger sårtillslutning.
Nedsatt migration av endotelceller är en underliggande orsak till sårläkningsstörning 4,5. Således metoder bedöma migration av tidiga endotelceller är skyldiga att utforska pathophysiolnik av cellmigrationsstörningar och för att identifiera nya strategier för terapeutisk intervention.
Hudexponering för alkyleringsmedel (t.ex. svavel- och kvävesenaps) orsakar sårläknings sjukdom 6. Sådana föreningar användes som kemiska stridsmedel i flera konflikter i 20-talet och fortfarande anledning till stark oro på grund av befintliga lager i politiskt instabila regioner och relativt enkel syntes. Även senapsgas syntetiserades första gången 1822, är den molekylära och klinisk patologi SM exponeringen inte förstås i detalj och ingen antidot för SM exponering har identifierats.
Flera studier har gjorts för att förstå och modellera försämrad sårläkning efter SM exponering och för att testa potentiella kandidat föreningar med förmåga att reservera ett liknande resonemang. Schmidt et al., (2009) testade effekten av klorambucil, ett alkylerande förening med egenskaper liknande SM i mouSE embryoid karossmodeller och hittade en dramatisk, ibland mer än 99% minskning av kärlbildning 7. Denna negativa effekt var mest uttalad vid ett utvecklingsstadium, som, under fysiologiska betingelser, domineras av proliferationen och migreringen av vaskulära endoteliala prekursorceller. Således var dessa celler identifierades att vara särskilt känsliga för alkyleringsmedel. Steinritz et al., (2010) testade scavengers av reaktiva syreföreningar (ROS), särskilt, N-acetylcystein (NAC) och alfa-linolensyra (ALA) för deras förmåga att reducera SM toxicitet i mus embryoid karossmodeller och i synnerhet till återställa kärlbildning 8. Tillfälliga skyddande effekter observerades, vilket tyder på att alltför ROS bildning var sannolikt att bidra till de negativa effekterna av SM på sårläkning. Dessa effekter var inte permanent och de två kandidatföreningar kanske inte är möjligt att återställa kärlbildning och sårläkning på lång sikt 8. However, har dessa experiment i en komplex 3D-modell som tillät undersökning av cellmigration. Således vi sedan testade NAC och ALA för positiva effekter på cellmigration av EEG som har en nyckelroll i processen för kärlbildning 9.
Dessutom finns det bevis för att cellpolaritet krävs för cellmigration. Mitochondrial dysfunktion leder till ROS bildning visades försämra cellpolaritet och kan således negativt påverka cellmigration. Därför var levande cell imaging med avseende på mitokondriell funktion som utförs och effekterna av ROS asätare undersöktes. Följande protokoll beskriver allmänna krav för odling av EEG, kammar analysen Boyden, sårläknings analysen inklusive spårning cellanalys och användning av TMRM för bedömning av mitokondriefunktion i detalj. Viktiga aspekter av experimentella protokoll för EEG odling och migration är markerade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dermal exponering för giftiga kemikalier resulterar ofta i svår sårläkning sjukdom. De bakomliggande mekanismerna är i stort sett okända. Sårläkning är en komplex process som består av olika faser (hemostas, inflammation, spridning och remodeling). Cellmigration är involverad i varje fas, är det emellertid av största betydelse för bildandet av granulationsvävnad. Här är nya blodkärl bildas antingen genom angio- eller vaskulogenes.
Båda processerna kräver opåverkad migrat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration – Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
