Método para medir a actividade de enzimas deubiquitinating em linhas celulares e amostras de tecidos
Summary
O protocolo atual detalha um método para medir a atividade das enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializados modificar covalentemente o enzima e permitir a detecção. Este método tem o potencial para identificar novos alvos terapêuticos.
Abstract
O sistema ubiquitina-proteassoma tem sido recentemente implicado em diversas patologias, incluindo as doenças neurodegenerativas e cancro. À luz disto, técnicas para estudar o mecanismo de regulação deste sistema são essenciais para elucidar os processos celulares e moleculares das doenças acima mencionadas. A utilização de sondas derivado de hemaglutinina ubiquitina descritos neste documento serve como uma ferramenta valiosa para o estudo deste sistema. Este artigo detalha um método que permite ao usuário realizar ensaios que dão uma visualização direta do deubiquitinating atividade enzimática. Deubiquitinating controlar a degradação proteossómica e compartilhar homologia funcional em seus sítios ativos, o que permite ao usuário investigar a atividade de várias enzimas em um ensaio. Lysates são obtidos através de suave rompimento celular mecânica e incubadas com o site ativo sondas dirigidas. Enzimas funcionais são marcados com as sondas enquanto enzimas inativos permanecem não ligados. Por prazoNing este ensaio, o utilizador obtém informações sobre a actividade, tanto a expressão e potencial de várias enzimas deubiquitinating de uma maneira fácil e rápida. O método actual é significativamente mais eficiente do que a utilização de anticorpos específicos para os preditos cem enzimas deubiquitinating na célula humana.
Introduction
O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) serve como uma das principais vias de degradação na célula de mamífero. Substratos ligados à degradação no proteassoma são covalentemente marcados com polímeros de ubiquitina (Ub) 1. Antes do substrato alvo entra no proteassoma para a degradação, a etiqueta de poli-ubiquitina deve ser removido. Uma classe de enzimas conhecidas como deubiquitinating enzimas (Dubs) é responsável pela remoção e reciclagem de moléculas de ubiquitina 2. Prevê-se a partir do genoma humano que há quase uma centena de dobragens de trabalho na célula 3. Com um grande número de dubs que controlam processos celulares Ub mediadas tal, estudando estas enzimas apresenta um desafio desde técnicas de mRNA não dão informação sobre a actividade e transferência de western só dá informações sobre os níveis de expressão.
A utilização da gripe hemaglutinina (HA) com etiquetas, Ub-derivado local dirigida sondas activas permite uma modificação covalenteficação das dobragens funcionais e, por conseguinte, dá uma visualização directa da actividade destas enzimas sobre um western blot 4. As sondas têm um grupo reactivo tiol C-terminal que serve como um substrato para o suicídio resíduo cisteína local activo 5. Com estas sondas, é possível estudar a expressão e a actividade potencial de muitos dobragens em ambos os estados patológicos e fisiológicos da célula.
Alterações na actividade DUB têm sido implicados numa variedade de condições patológicas tais como doença de Parkinson, doença de Alzheimer, anemia e vários cancros 6-10. Esta técnica fornece uma ferramenta poderosa para o estudo da doença. No presente trabalho, mostramos a aplicação desta técnica em células HeLa e M17 que foram ligado usando esferas de vidro. Além disso, destacamos como usar esse método em amostras de tecido de rato medula espinhal. A informação obtida a partir desta técnica pode ser usada como um ponto de partida para a identificaçãoalvos terapêuticos, bem como o estabelecimento de modelos para o estudo de diferentes condições de doença. A verdadeira utilidade desta técnica reside na sua capacidade de fornecer informações sobre vários Dubs em um único ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desde ubiquitinação é uma actividade celular fundamental, a compreensão dos mecanismos de regulação poderia ser a chave para desenterrar os processos de doença e patologia. O uso de HA etiquetado local dirigida sondas ativas Ub-derivadas aqui relatados fornece um método fácil, mas altamente aplicável para estudar a degradação de proteínas mediada por Ub. Este método é mais rápido e menos dispendioso do que o estudo de cada uma das dobragens individualmente.
Neste método, a l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao laboratório Lee, da Universidade de Minnesota para fornecer o rato espinhal amostras de tecido espinhal que foram usados. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa do ovário Cancer Research Program (OCRP) OC093424 a MB, pelo Fundo de Investigação e Comunidade Cancer Randy Shaver para MB e pelo Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) para MB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
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