Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem
Summary
Geçerli protokol işlevsel homolog deubiquitinating enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem göstermektedir. Uzman problar kovalent enzim değiştirme ve saptama için izin verir. Bu yöntem, yeni tedavi hedefleri tespit etmek potansiyele sahiptir.
Abstract
ubikitin-proteazom sistemi son nörodejeneratif hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere çeşitli patolojilerde rol oynar. Bunun ışığında, bu sistemin düzenleyici mekanizmasını incelemek için teknikler yukarıda belirtilen hastalıkların hücresel ve moleküler süreçleri açıklık için gereklidir. Bu yazıda belirtilen hemagglutinin türetilmiş ubikitin sondasının kullanımı bu sistemin çalışması için değerli bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yazıda enzim aktivitesini deubiquitinating doğrudan görselleştirme vermek tahlilleri yapmasını sağlayan bir yöntem ayrıntıları. Deubiquitinating enzimler proteozomal bozulmasını kontrol ve kullanıcı bir deneyde birden enzimlerin aktivitesini araştırmak için izin verir aktif siteler, fonksiyonel benzerlik paylaşıyoruz. Lizatlar yumuşak mekanik hücre bozulması yoluyla elde edilen ve aktif site yönelimli probları ile inkübe edilir. Inaktif enzimler ilişkisiz kalırken Fonksiyonel enzimler probları ile etiketlenmiş. Run byNing bu deney, kullanım etkinliği ve hızlı ve kolay bir şekilde birden fazla deubiquitinating enzimlerin potansiyel ekspresyon hem de ilgili bilgileri alır. Mevcut yöntem, insan hücresinde tahmin yüz deubiquitinating enzimler için tek tek antikorlar kullanılarak önemli ölçüde daha etkilidir.
Introduction
ubikitin-proteazom sistemi (UPS) memeli hücresinde ana degradasyon yollarının biri olarak hizmet eder. Proteazomdan bozulmaya gitmekte Dayanaklar kovalent ubikuitin (Ub) 1 polimerleri ile etiketlenmiş. Hedef alt-tabaka bozulması için proteazomu girer önce, poli-ubikitin etiketi çıkarılmalıdır. Enzimler (DUBS) deubiquitinating olarak bilinen bir enzimler sınıfı ubikitin moleküllerinin 2 çıkarılması ve geri dönüşüm için sorumludur. Bu hücrede 3 çalışan yaklaşık yüz seslendirmeler olduğu İnsan genomunun tahmin edilmiştir. Ub-aracılı hücresel süreçleri kontrol DUBS bu kadar büyük bir sayı ile, bu enzimleri okuyan, yalnızca ifade seviyeleri hakkında bilgi verir mRNA teknikleri aktivite ve batı blot hakkında bilgi vermeyin çünkü bir meydan okuma sunuyor.
grip hemaglutinin (HA) kullanımı kovalent mod sağlayan aktif bölge yönlendirilmiş sondalar Ub türetilmiş, etiketliFonksiyonel takar ve bu yüzden de US-PS bir Batı lekesi 4, bu enzimlerin aktivitesinin doğrudan görselleştirme verir. Problar, aktif alan sistein kalıntısı 5 için bir intihar alt-tabaka olarak hizmet eden bir C-terminali tiol reaktif grup var. Bu problar ile, hücrenin her iki patolojik ve fizyolojik halleri altında birçok DUBS aktivitesini ve potansiyel ifade incelemek mümkündür.
DUB aktivitesindeki değişiklikler, Parkinson, Alzheimer, anemi ve çeşitli kanserler gibi patolojik koşullar 6-10 aralığında implike edilmiştir. Bu teknik, hastalığın çalışma için güçlü bir araç sunar. Bu yazıda, biz cam boncuklar kullanılarak lize edilmiş HeLa ve M17 hücrelerinde bu tekniğin uygulanmasını gösterir. Ayrıca, fare omurilik doku örneklerinde bu yöntemi kullanmak nasıl özetlemektedir. Bu tekniği ile elde edilen bilgiler, tanımlanması için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilirterapötik hedefler ve farklı hastalık durumlarının çalışma için oluşturulması modelleri. Bu tekniğin gerçek yardımcı tek bir deneyde çok dubs bilgi sağlama yeteneğinde yatmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubikuitinasyon temel hücresel aktivite olduğundan, düzenleyici mekanizmaların anlaşılması hastalık ve patoloji süreçlerini ortaya çıkarılması için anahtar olabilir. HA kullanımı Burada rapor Ub türetilmiş aktif bölgeye yönelik sondalar Ub-aracılı protein parçalanmasını eğitimi için kolay, ama çok geçerli bir yöntem sağlar etiketledi. Bu yöntem daha hızlı ve daha az pahalı ayrı DUBS her biri eğitim fazladır.
Cam boncuklar kullanılarak – Bu yöntemde, h?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kullanılan fare omurilik doku örnekleri sağlamak için Minnesota Üniversitesi Lee laboratuvarını teşekkür etmek istiyorum. Bu eser MB Randy Tıraş Makinesi Kanser Araştırma ve Toplum Fonu tarafından ve Minnesota Yumurtalık Kanseri Birliği (MOCA) MB'ye göre, Savunma Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) MB OC093424 Bölümü tarafından desteklenmiştir. fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya yazının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
