Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters
Summary
Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.
Abstract
De ubiquitine-proteasoom-systeem is onlangs betrokken bij diverse pathologieën waaronder neurodegeneratieve ziekten en kanker. Gezien deze technieken voor het bestuderen van reguleringsmechanisme van dit systeem zijn essentieel voor het ophelderen van de cellulaire en moleculaire processen van bovengenoemde ziekten. Het gebruik van hemagglutinine afkomstig ubiquitine probes die in dit document dient als een waardevol hulpmiddel voor de studie van dit systeem. Deze paper Gegevens een methode die de gebruiker in staat stelt om te testen die een directe visualisatie van ubiquitinerings enzymactiviteit te voeren. Ubiquitinerings enzymen regelen proteasomale afbraak en functionele homologie delen hun actieve plaatsen, waarmee de gebruiker de activiteit van verschillende enzymen in een assay te onderzoeken. Lysaten worden verkregen door middel van zachte mechanische celdisruptie en geïncubeerd met actieve plaatsgerichte probes. Functionele enzymen worden gelabeld met de sondes tijdens inactieve enzymen ongebonden blijven. Door running deze test krijgt de gebruiker informatie over zowel de activiteit en mogelijke expressie van meerdere ubiquitinerings enzymen op een snelle en gemakkelijke wijze. De huidige methode is significant efficiënter dan het gebruik van afzonderlijke antilichamen voor de voorspelde honderd ubiquitinerings enzymen in de menselijke cel.
Introduction
De ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) dient als een van de belangrijkste afbraakroutes in de zoogdiercel. Substraten gebonden voor de afbraak in het proteasoom covalent gelabeld met polymeren van ubiquitine (Ub) 1. Voor het beoogde substraat komt het proteasoom voor afbraak, moet de poly-ubiquitine tag verwijderd. Een klasse van enzymen bekend als ubiquitinerings enzymen (Dubs) is verantwoordelijk voor de verwijdering en recycling van ubiquitine moleculen 2. Volgens schattingen van het menselijk genoom dat er bijna honderd Kopieën die in de cel 3. Met een dergelijk groot aantal nasynchroniseert regelen Ub-gemedieerde cellulaire processen bestuderen van deze enzymen een uitdaging omdat mRNA technieken geen informatie over de activiteit en Western blotting geven geeft alleen informatie over expressieniveaus.
Het gebruik van influenza hemagglutinine (HA) tag, Ub-afgeleide actieve plaatsgerichte probes maakt een covalente modcatie van de functionele nasynchroniseert en derhalve geeft een directe visualisatie van de activiteit van deze enzymen op een western blot 4. De probes hebben een C-eindstandige thiol reactieve groep die dient als zelfmoord substraat voor de actieve plaats cysteïnerest 5. Met deze sondes is het mogelijk om de activiteit en mogelijke expressie van vele nasynchroniseert studeren bij zowel fysiologische en pathologische toestanden van de cel.
Veranderingen in DUB activiteit zijn betrokken bij een aantal pathologische aandoeningen zoals Parkinson, Alzheimer, anemie en diverse kankers 6-10. Deze techniek verschaft een krachtig hulpmiddel voor de studie van ziekten. In het onderhavige document tonen wij de toepassing van deze techniek in HeLa en M17-cellen die werden gelyseerd middels glasparels. Daarnaast hebben we schetsen hoe deze methode in de muis ruggenmerg weefselmonsters gebruiken. De resultaten van deze techniek informatie kan worden gebruikt als uitgangspunt voor het identificerentherapeutische doelen alsmede vaststelling modellen voor de studie van verschillende aandoeningen. De werkelijke bruikbaarheid van deze techniek ligt in het vermogen om informatie op meerdere Kopieën voorzien in een enkele assay.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aangezien ubiquitinatie is een fundamenteel celactiviteit begrijpen van de regelmechanismen kan de sleutel opgraven de processen van ziekte en pathologie. Het gebruik van HA tag Ub-afgeleide actieve gerichte sondes hier gemeld biedt een eenvoudige, maar zeer toepasbare methode voor het bestuderen van Ub-gemedieerde afbraak van eiwitten. Deze werkwijze is sneller en goedkoper dan het bestuderen elk van de dubs afzonderlijk.
In deze werkwijze, wordt de lyse van de cellen bereikt door mechanisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag de Lee lab van de Universiteit van Minnesota bedanken voor het verstrekken van de muis ruggenmerg weefselmonsters die werden gebruikt. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 naar MB, door de Randy Shaver Cancer Research Fund en Gemeenschap MB en door de Minnesota eierstokkanker Alliance (MOCA) naar MB. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
