Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em> Streptococcus iniae</em> Enfeksiyon
Summary
Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.
Abstract
su patojen, Streptococcus iniae, su ürünleri sektörü için yıllık kayıpları 100 milyon dolar sorumludur ve balık ve insanlarda hem de sistemik hastalığa neden yeteneğine sahiptir. S. daha iyi anlaşılması iniae hastalığı patogenezinde uygun bir model sistem gerektirir. floresan bağışıklık hücrelerini etiketli ile genetik tractability ve Zebra balığı erken gelişim evrelerinde optik şeffaflık transgenik hatları üretimi ve non-invaziv görüntüleme için izin verir. birkaç hafta döllenme sonrası dek adaptif bağışıklık sistemi tamamen işlevsel değil, ama Zebra balığı larvaları nötrofiller ve makrofajlar hem korunmuş omurgalı doğuştan gelen bağışıklık sistemi var. Böylece, bir larva enfeksiyon modelinin üretimi S. kontrol sırasında bağışıklık özel katkı çalışma sağlar iniae enfeksiyonu.
Mikroenjeksiyon site bir enfeksiyon olup olmadığını belirleyeceksistemik ya da ilk olarak lokalize. Burada, biz otik vezikül Zebra balığı yaşlı 2-3 gün sonrası döllenme enjeksiyonu yanı sıra enfeksiyon floresan konfokal görüntüleme için teknikler bizim protokolleri sunuyoruz. Bir lokalize enfeksiyon sitesi ilk mikrop istilası gözlem, konak hücrelerin işe ve enfeksiyon yayılmasını sağlar. S. Zebra balığı larva modelini kullanarak Bulgularımız iniae enfeksiyonu zebra balığı lokalize bakteriyel enfeksiyonların konakçı nötrofil ve makrofajların farklı katkıları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, bağışıklık hücrelerinin photolabeling enfeksiyonun seyri sırasında bireysel konakçı hücre gelişmeyi izlemek için kullanılabilir açıklanmıştır.
Introduction
Streptococcus iniae balık ve insanlarda 1 hem de sistemik hastalığa sebep olup büyük bir su patojendir. S. iken iniae su ürünleri sektöründe büyük kayıplar için sorumlu, aynı zamanda diğer streptokok insan patojenlerin neden olanlara benzer klinik patolojilerin ile bağışıklığı insan konaklarda hastalığa neden yeteneğine potansiyel zoonotik patojen olduğunu. Insan patojenleri ile benzerlikler göz önüne alındığında, bu çalışma S. önemlidir Doğal ev sahibi bağlamında iniae hastalığı patogenezi. S. Bir yetişkin zebrabalıkları modeli iniae enfeksiyonu enfeksiyon lokalize sitede yanı sıra ölümü barındırmak için hızlı bir zaman ev sahibi lökositlerin sağlam infiltrasyonu ortaya, çok kısa bir zaman adaptif bağışıklık sistemini 7 dahil etmek. Kazanmak için bir derinlemesine S. doğuştan bağışıklık yanıtı içine bakmak in vivo enfeksiyon iniae, bu n daha uygun bir model kullanmak için gerekli olanon-invaziv canlı görüntüleme.
larva Zebra balığı bu konak-patojen etkileşimleri çalışmak için giderek cazip omurgalı modeli yapmak avantajları bir numarası vardır. Balığı kullanımı ve memeli modellere göre korumak için nispeten ucuz ve kolaydır. Adaptif bağışıklık 4-6 hafta sonrası döllenme kadar işlevsel olgun değil, fakat larva fagositozu ve solunum patlaması 2-6 olmak üzere antimikrobiyal özellikleri ile tamamlayıcısı, Toll benzeri reseptörler, sitokinler, ve nötrofiller ve makrofajlar ile yüksek oranda korunmuş omurgalı doğuştan bağışıklık sistemine sahip, 8-11. Buna ek olarak, genetik izlenebilirliği ve geliştirme embriyonik ve larva aşamalarında optik saydamlık ile floresanla işaretlenmiş bağışıklık hücreleri mümkün in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak konukçu-patojen etkileşimlerine incelemek için yapım kararlı transgenik hatların üretilmesine izin verir. örneğin Den bir photoconvertible proteini kullanılarak bu transjenik nesildra2 enfeksiyonu 12 boyunca bireysel konak hücre kökeni ve kaderi takibi sağlar.
Bir Zebra balığı larva enfeksiyon modeli geliştirirken, mikroenjeksiyon seçilen site, enfeksiyon başlangıçta lokalize veya sistemik olup olmadığını belirleyecektir. Kaudal ven veya Cuvier ve Duct içine sistemik kan enfeksiyonları en sık zebrabalıkları mikrobiyal patojenlerin incelemek için kullanılan ve patojen suşları arasında virulenslikte ev sahibi ve mikrobiyal hücrelerin, sitokin yanıtları ve farklılıklar arasındaki etkileşimleri incelemek için yararlı olmaktadır. Yavaş gelişen mikroorganizmalar için, 16-1,000 hücre aşamasında bir embriyo yumurta sarısı kesesinin içine ilk enjeksiyon arasında olduğu bir yavaş büyüyen mikroorganizmaların mikroenjeksiyon için uygun gelişim aşamasında olan, sistemik bir enfeksiyon 13,14 oluşturmak için kullanılabilir 16-128 hücre aşaması 15. Ancak, ev sahibi gelişiminin sonraki aşamalarında birçok mikropların kesesi enjeksiyonları sarısı t öldürücü olma eğilimindedirO lökositler 16-18 sızma mikrop ve eksikliği için besin açısından zengin bir ortamda nedeniyle ev sahipliği.
Bir lokalize enfeksiyon genellikle kolayca non-invaziv görüntüleme ile ölçülebilir enfeksiyon sitenin yönelik lökositlerin yönettiği göç sonuçlanır. Enfeksiyon Bu tür lökosit göçünü yanı sıra çeşitli lökosit popülasyonlarının farklı göçmen ve fagositik yetenekleri soruşturma aracılık mekanizmaların diseksiyon için izin verebilirsiniz. Bakteri türleri arasındaki virulenslikte farklılıkları inceleyen yanı sıra fiziksel ana engeller sistemik olmak için yerelleştirilmiş enfeksiyonu için geçti gerekir çünkü mikrop istilası mekanizmaları okuyan zaman lokalize enfeksiyonlar da yararlıdır. Balığı, tipik olarak 25-31 ° C 19 arasındaki sıcaklıklarda yetiştirilir fakat aynı zamanda sıkı bir sıcaklık şartlarına belirli insan patojen invaziflik çalışmaları için 34-35 ° C kadar yüksek bir sıcaklıkta muhafaza edilebilirvirülans 20, 21.
Birçok farklı sitelerde Beyin ventrikül 22, sırt kuyruk kas 18, perikardiyal boşluğu 23 ve otik vezikül (kulak) 5, 16, 24 dahil olmak üzere bir ilk lokal bakteriyel enfeksiyonun oluşturmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, lökosit yanıtı 13 araştırılırken sonuçları çarpıtabilir bakteri, doku hasarı ve inflamasyon bağımsız neden olabilir kuyruk kas içine bakteri enjeksiyonunun bulunmuştur. Daha az hasar Beyin içine enjeksiyonu ile ilişkili ve genç embriyoların lökositlerin başlangıçta yoksun olmasına rağmen mikrogliya ikamet almak gibi, Beyin ventrikül giderek zamanla daha bağışıklık hücrelerini kazanır rağmen. Beyin ventrikül da görüntü bir daha zor bir konumdur. otik vezikül damar 25, 26 doğrudan erişimi olan kapalı içi boş boşluktur. Bu leu normal olarak yoksunkocytes ama lökositlerin enfeksiyon gibi iltihap uyarıcıya tepki olarak otik veziküle iyileştirilebilirler. Aynı zamanda, çünkü görüntüleme kolaylığı ve enjeksiyon görselleştirme Zebra balığı yaşlı 2-3 gün sonrası fertilizasyon (dpf) bakteri mikroenjeksiyon tercih edilen bir sitedir. Bu nedenle, biz lokalize bakteriyel enfeksiyon sitemizde olarak otik vezikül seçti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada kullanılan enfeksiyon yöntemi 2-3 dpf embriyolar ve larvaların bir ilk lokal enfeksiyona konak bağışıklık tepkisinin incelenmesi için yararlıdır. Bu tür kulak kesecik gibi kapalı bir boşlukta enfeksiyon gibi bir enflamatuar uyarıcı, odak nötrofil ve makrofaj kemotaksisi ve fagositoz çalışma sağlar. Otik vezikülleri içine bakteri enjekte bir uyarı nötrofillerin yeteneği etkili bir sıvı dolu boşluklarında fagosite ederler bakteriler, özellikle bir mikrop bağlı olabilir olmasıdır. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Zebra balığı bakımı ve bakım için laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, EA HARVIE Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü A155397 ve Anna Huttenlocher NIH R01GM074827 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.7 ml eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x 1/2 in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96 well plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 mm x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
