In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
合成材料是已知的时血管代用品植入以引发临床并发症如炎症,狭窄,和感染。胶原已被广泛地用于各种各样的生物医学应用,被认为是一个有效的替代合成材料由于其固有的生物相容性( 即 ,低抗原性,炎症和细胞毒性的响应)。然而,有限的力学性能和胶原凝胶的相关低手的能力,阻碍了其作为支架材料的血管组织工程中使用。因此,这背后的工作的基本原理是第一个工程细胞化胶原凝胶成筒状的几何形状和第二提升平滑肌细胞的胶原基质的驱动重组,以获得组织僵硬足以进行处理。
这里描述的策略是基于胶原和平滑肌细胞(构建)的三维cyli直接装配ndrical几何与使用一模制技术。这个过程需要一个成熟期间,在此期间,结构是在静态条件下的生物反应器培养(没有施加外部动态机械约束)处理1周或2周。 “静态生物反应器”提供了一种监测和控制无菌环境(pH,温度,气体交换,营养供应和废物清除)到构建体。在培养期间,厚度的测量进行评估胶原基质的细胞驱动的重塑,以及葡萄糖消耗和乳酸生产速率进行测定,以监测细胞的代谢活性。最后,机械和粘弹性能进行了评估对于所得的管状结构。为此目的,特定协议和聚焦诀窍(操纵,握持,在水合环境下工作,等等)被开发来表征的工程化组织。
血管组织工程设想旨在设计容器制作,包括基于合成的支架,细胞片基组织工程血管(TEBVs),和细胞外基质(ECM)的移植物不同的策略组件基于TEBVs。在这些方法中,合成的聚合物表现出良好的机械性能,但都有一个共同的缺点,因为它们缺乏生物活性1。该细胞片基方法允许生产工程化血管代用品具有高机械性能的,但需要产生这种移植物的时间是约28 周 3。 ECM的天然生物聚合物,如胶原,弹性蛋白,纤维蛋白3或它们的组合,仍然是组织工程支架的黄金标准材料。这主要是为这些材料具有大致良好的生物相容性,同时能够诱导功能性细胞应答4-5的原因。在这些生物聚合物S,I型胶原蛋白是细胞外基质中的许多组织如皮肤,血管和腱的最丰富的和主要的承重蛋白之一。大量的工作已经进行了6胶原蛋白的力学性能– 8,但也出现了只有少数研究对胶原凝胶在静态成熟细胞重塑。蜂窝重塑是指诱导细胞可能影响胶原纤维网络9的稳定胶原基质的结构修饰。作为天然的支架,相对大量的I型胶原的可以分离,灭菌,并从不同的来源,例如鼠尾腱10存储。了解胶原蛋白细胞相互作用和细胞化胶原支架(结构)的有关整体力学行为是组织建设的一个重要步骤。基于胶原的TEBVs可以通过直接混合细胞与胶原被加工凝胶制备期间和进一步模塑成特定的形状,例如管状的和平面11。凝胶内的血管细胞增殖和改造I型胶原12。因此,这种方法绕过需要,表示在支架用于组织工程应用的发展显著问题之一特定的大孔。然而,胶原凝胶的主要缺点是它们的低的机械性能相比,合成材料13。
在这项研究中,与细胞的均匀分布的活组织工程改造的胶原质与细胞的一步法直接混合。 “静态生物反应器”被用于1周或2周的细胞化的胶原凝胶的静态成熟的(没有施加外部动态机械约束)。在培养过程中,胶原基质重塑发生,从而提供了结构增强的结构。此外,这些结构如下:R伊迪被转移到一个旋转壁生物反应器和均匀的内皮达到了。另外,在此工作的特定机械测试协议还提出,以提供一个合适的新方法在表征的管状软组织的机械性能。
总之,本工作提出用于体外快速制造和是强大到足以进行处理不仅对生物和机械表征,同时也为进一步的机械调节在一个动态的生物反应器,它被认为是一种重要的血管组织的成熟的方法步骤中组织的再生。
间的血管组织工程师社区,巨大努力已经完成,以重现负责血管16的机械稳定性中膜层。自温伯格和贝尔17的开创性工作,胶原已被广泛地用作支架,因为其生物相容性,非免疫原性性能和可用性的血管组织工程。然而,使用胶原的表示为研究者一个很大的挑战,因为这种材料是不容易处理,由于固有缺乏机械刚度。支架在制备过程中的操作可能会损坏支架,损害它们供进一步使用。
在这项工作中所描述的技术允许:i)至工程师细胞化胶原凝胶成筒状的几何形状; ii)向工程师生物组织足够强短静态成熟期间(1或者2周)后进行处理; 3)为在2个方向,例如管状形状的生物体组织的自编码扩频通信的机械和粘弹性质。在凝胶细胞在胶原基质重塑中发挥关键作用。在成熟期间,收缩平滑肌细胞导致了凝胶,得到的构建体具有更高的机械稳定性,可以在纵向和圆周方向进行评估的压实。此后,内皮细胞接种在腔侧的构建体产生的均匀的和可行的内皮,从而表现出胶原凝胶血管组织工程应用的适用性。
在这项工作中提出的生物反应器是专门设计在静态成熟提供用于细胞生长的最佳环境。此外,对于该构建体的机械性能和粘弹性能表征开发的装置被设计,目的是减少固有的操作的任何潜在损害这种微妙的材料。因此,静态生物反应器中装有一个0.22微米的过滤器和过滤膜在盖(步骤1.1.2, 图1A的 和B),所允许的贮存器和培养箱内培养介质之间的气体交换,同时保持无菌培养环境。鲁尔隔膜在底部用作端口培养基取样和静态培养期间改变。一些关键的步骤都在构建制造和表征加以考虑。所有操作(在步骤2.1.1和在后续步骤中进行的)可能改变系统的无菌性是在无菌生物罩进行。细胞和胶原凝胶混合物制备物在冰上处理以延缓胶凝过程(步骤2.1.4至2.1.7)。在步骤2.1.7,任何气泡之前凝胶包埋在混合物是潜在的应力集中区域,可以妥协的S盈利能力的构造。因此,去除这种气泡,需要微微晃动组装或使用医疗真空3分钟的degasing在无菌条件下。最后,该夹具被用于维持心轴中心在凝胶化过程中,管状模具的轴线和用于允许在收获(去除心轴的,第2.4节),对于内皮细腻操纵构建体设计的,并且为便于安装到机械系统(纵向测试)。
本协议提出的胶原凝胶结构加固的基础上校董会自然收缩的内在潜能的原始易于处理的替代方法。的胶原基质加固常用技术涉及使用可对细胞-基质相互作用18的有害作用的物理和化学交联剂– 20。在给出的制造技术这项工作中允许引导此细胞驱动的重塑过程,得到一种组织工程化构建体与靶向的机械性能,没有任何物理或化学处理。
的水合胶原凝胶的机械和粘弹性能表征是一个巨大的挑战。从这个角度来看,本协议描述为评估管状软组织的力学性能的原始简单而有效的方法。这种表征可以执行不仅在圆周方向上,而且在纵向上,直接在整个管状结构。在机械特性,温度,水环境,pH和离子强度是一些已知显着影响生物组织21的机械行为的环境因素。因此,目前的工作表明,在一个高的初始设置和协议,用于生物组织的机械特性重现的伪生理环境(37℃和pH 7.4的盐水溶液)。尽我们所知,这种表征从未在别处报道。
总之,在此工作提出的技术证明细胞与胶原血管组织工程应用直接混合的高电位。这与机械特性和内皮过程方法一起构成高多价协议。因此,通过该组窗口和同时保持相同的基本原理的协议的轻微的修改,对于工程血管组织当量主要要求是可以解决诸如快速和简单的处理,包括内皮,并有可能被移植到大范围的软组织中具有各种长度和直径。此外,不同的贴壁细胞类型,细胞外基质蛋白和几何形状的成型可以考察了一些有针对性的applicati的项,如工程腱,皮肤移植,心脏修补,神经等。虽然该构建体的机械性能是令人鼓舞的,它们比那些天然组织的更低。在此背景下,我们坚信,在很短的静态成熟期是朝着动态的刺激到生物反应器中的一个关键步骤,从而导致更高的结构完整性和机械稳定性。然而,有可能迅速产生组织工程细胞化的基于胶原构建体适合机械和组织学分析,使本文所述的有用且有希望的工具来生长和重建,或甚至在洞察细胞和细胞外基质之间的相互作用的静态生物反应器作为一个模型用于治疗和药物递送系统。
The authors have nothing to disclose.
该研究是由自然科学和加拿大工程研究理事会,加拿大卫生研究院和麟德魁北克研究中心。
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |